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 标准品制备有关信息

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1. 定量定义 定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。 将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行 PCR 反应。以标准品拷贝数的对数值为 横坐标，以测得的 CT 值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品 的 CT 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。 （起始浓度）与循环数呈线性关系， 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 即得 到该扩增反应存在的线性关系 * 由样品 CT 值，就可以计算出样品中所含的模板量

2. 定量标准品 标准品的一些标准 * 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同 * 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是 ASP-3700 紫外光/可见光微量分光光度 计） * 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数） * 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定 CT 值 标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒 DNA，也可以是比扩增片段长的纯化 后的 PCR 产物，当然也可以是基因组 DNA，甚至 cDNA，但前提是所有的作为标准品的核 酸都必须保证稳定。

3. 标准品的制备
一般一条标准曲线取四到五个点， 浓度范围要能覆盖样品的浓度区间， 以保证定量
的准确性。 一般一个点重复三至五次， 对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。 倍比梯度稀释方法： 1v 原液（标准品 i）+9v 稀释缓冲液，得标准品 ii 1v 标准品 ii+9v 稀释缓冲液，得标准品 iii 1v 标准品 iii+9v 稀释缓冲液，得标准品 iv 1v 标准品 iv+9v 稀释缓冲液，得标准品 v 依次倍比稀释 拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算

4. 实例标准品的制作：将标准品依次进行 10 倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数 1.55×108copy /ul 标准曲线的绘制（1cycle=1min） 设置对照：浓度为 1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、 1.55×101 的标准样品各一个，设空白对照 PCR 反应：以不同浓度标准品作为模板
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