本试剂盒应用酶联免疫竞争法测定标本中游离脂肪酸（NEFA）水平。用纯化的游离脂肪酸（NEFA）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入游离脂肪酸（NEFA），和HRP标记的游离脂肪酸（NEFA）抗原，使它们竞争结合，，经过洗涤后加底物TMB显色。样本颜色的深浅和样品中的游离脂肪酸（NEFA）的含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中游离脂肪酸（NEFA）的含量。  

标本要求

1．标本处理：（1）水样   采集后经 -20℃反复冻融三次，再经玻璃纤维过滤后，备查

（2）组织   样品用丁醇：甲醇：水(5：25：70 V：V：V)抽提，或按相关文献提取进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，备查

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 加样：分别设标准孔、空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔中加50微升，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。  

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

7. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

8. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。