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使用 Liberty Blue™ 和 Liberty PRIME™ 多肽合成儀可以快速、高純度進(jìn)行頭尾環(huán)化肽的全自動(dòng)合成。微波增強(qiáng)的多肽固相合成（SPPS）不僅有利于線性組裝，而且有利于隨后的環(huán)化步驟，在各種困難的生物學(xué)重要肽上實(shí)現(xiàn)了ji高的純度合成。Liberty PRIME 上使用的一鍋法 Fmoc SPPS 循環(huán)進(jìn)一步改善合成時(shí)間、減少浪費(fèi)。

表1 ：全自動(dòng)合成首尾相連的環(huán)化肽

表2：Liberty Blue 和 Liberty PRIME 合成 Cyclorasin A¹

引言

環(huán)肽能夠橋接小分子和抗體之間的化學(xué)空間間隙，允許設(shè)計(jì)具有高結(jié)合親和力、顯著選擇性、低毒性和進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的能力的分子²。因此，大環(huán)肽作為靶向傳統(tǒng)上無法成藥的生物靶點(diǎn)的治療劑具有相當(dāng)大的前景³。截至 2017 年，超過 40 種環(huán)肽用于臨床⁴。環(huán)肽作為候選藥物開發(fā)的這一令人鼓舞的趨勢(shì)，為發(fā)展更穩(wěn)健的制備方法提供了動(dòng)力。

SPPS 可以通過使用 Fmoc-Glu-ODmab 作為 C 端氨基酸 (圖 1) 制備首尾相連環(huán)化肽。在合成線性肽骨架后，可以使用稀肼溶液選擇性地去保護(hù) Dmab 基團(tuán)。之后，可以使用微波增強(qiáng)偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)首尾環(huán)化。將微波能量應(yīng)用于首尾環(huán)化肽的合成可以實(shí)現(xiàn)更有效的偶聯(lián)，從而加快合成時(shí)間和提高純度 (CarboMAX™)⁵。

圖 1：Fmoc-Glu-ODmab ( 左 ); 

Fmoc-Glu(Wang resin LL)- ODmab (右)

材料與方法

試劑

以下含有zhi定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán) Fmoc 氨基酸購(gòu)自 CEM Corporation (Matthews, NC) 并：Ala、Arg (Pbf)、Gly、His (Boc)、Ile、Leu、Lys (Boc)、Thr (tBu) )、Trp (Boc)、Tyr (tBu) 和 Val。Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購(gòu)自 CEM Corporation。Fmoc-Glu-ODmab、Fmoc-Glu(Wang)-ODmab LL 樹脂、FmocD-Ala- OH 和 Fmoc-4-氟-L-苯丙氨酸購(gòu)自 EMD Millipore (Burlington, MA)。Fmoc-D-2-Nal-OH、FmocD-Nle-OH 和 Fmoc-N-甲基-L-苯丙 氨酸購(gòu)自 Bachem (T orrance, CA)。Fmoc-N-甲基-異亮氨酸-OH 購(gòu)自 Advanced ChemTech (Louisville, KY)。FmocN-甲基-亮氨酸-OH 購(gòu)自 Alfa Aesar (Haverhill, MA)。水合肼、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、Fmoc-N-甲基-甘氨酸-OH、N,N'-二異丙基碳二亞胺 (DIC)、哌啶、吡咯烷、三fu乙suan (TFA)、3,6-dioxa-1、 8 辛二硫醇(DODT) 和三異丙基硅烷 (TIS) 購(gòu)自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、無水乙mi (Et2O) 和乙酸購(gòu)自 VWR (Radnor, PA)。LC-MS 級(jí)水 (H2O) 和 LC-MS 級(jí)乙腈 (MeCN) 購(gòu)自 Fisher Scientific (Hampton, NH) 。

多肽合成：CEM 7-mer, cyclo-[GVYLHIE] 

使用 CEM Liberty Blue 自動(dòng)微波多肽合成儀，在 Fmoc- Glu(Wang)- ODmab 樹脂（離子交換容量：0.025 meq/g）上，以 0.10 mmol 的規(guī)模合成（Dmab 脫保護(hù)以0.05 mmol 規(guī)模進(jìn)行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol的規(guī)模進(jìn)行）。使用 DMF 中的哌啶進(jìn)行脫保護(hù)。

偶聯(lián)反應(yīng)在5倍量的Fmoc氨基酸,DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵ 中進(jìn)行。使用肼的 DMF 溶液進(jìn)行 ODmab 基團(tuán)的脫保護(hù)。首尾環(huán)化反應(yīng)使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進(jìn)行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進(jìn)行切割。裂解后無水乙mi沉淀肽并過夜凍干。

圖2：CEM 7-mer

使 用 CEM Liberty Blue 自 動(dòng) 微 波 多 肽 合 成 儀 ， 在 Rink Amide ProTide LL 樹脂 (離子交換容量：0.19 meq/g ）上，以 0.05 mmol 的規(guī)模合成（Dmab脫保護(hù)以 0.05 mmol 的規(guī)模進(jìn)行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進(jìn)行）。使用 DMF 中的哌啶進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍Fmoc氨基酸、DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵中進(jìn)行。Fmoc-Glu-ODmab 用做第一個(gè)氨基酸（Q）。使用肼的 DMF 溶液進(jìn)行 ODmab 基團(tuán)的脫保護(hù)。首尾環(huán)化反應(yīng)使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進(jìn)行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進(jìn)行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并過夜凍干。

多肽合成：Cyclorasin A, cyclo-[WTaRRR-nal-R-Fpa-nle-Q](Liberty PRIME)

使用 CEM Liberty PRIME 自動(dòng)微波多肽合成儀，在  Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上，以 0.05 mmol 規(guī)模合成（Dmab脫保護(hù)以 0.05 mmol 的規(guī)模進(jìn)行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進(jìn)行）。使用 DMF 中的吡咯烷進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍 Fmoc 氨基酸、DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵中進(jìn)行。Fmoc-Glu-ODmab 用做第一個(gè)氨基酸（Q）。使用肼的 DMF 溶液進(jìn)行 ODmab 基團(tuán)的脫保護(hù)。使用肼的 DMF 溶液進(jìn)行 ODmab 基團(tuán)的脫保護(hù)。首尾環(huán)化反應(yīng)使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進(jìn)行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H₂O/TIS/ DODT 進(jìn)行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

圖3：Cyclorasin A

使用 CEM Liberty PRIME 自動(dòng)微波肽合成儀在 Fmoc-Glu (Wang ) -ODmab 樹脂（離子交換容量：0.25 meq/g ）上以 0.05 mmol 的 規(guī)模合成（Dmab 脫保護(hù)以 0.05 mmol 規(guī)模進(jìn)行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進(jìn)行）。使用 DMF 中的吡咯烷進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍 Fmoc 氨基酸、DIC和Oxyma Pure（CarboMAX）⁵中進(jìn)行。使用肼的 DMF 溶液進(jìn)行 ODmab 基團(tuán)的脫保護(hù)。首尾環(huán)化反應(yīng)使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進(jìn)行。在CEM RazorTM高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進(jìn)行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽 并凍干過夜。

圖4：N-Methyl Cyclorain Analog

使 用 CEM Liberty PRIME 自 動(dòng) 微 波 肽 合 成 儀 在 Fmoc-Glu (Wang )-ODmab 樹脂（離子交換容量：0.25 meq/g ）上以 0.1 mmol 的規(guī)模合成（Dmab 脫保護(hù)以 0.05 mmol 規(guī)模進(jìn)行，首尾環(huán)化以 0.025 mmol 的規(guī)模進(jìn)行）。使用 DMF 中的吡咯烷進(jìn)行脫保護(hù) 。偶 聯(lián) 反 應(yīng) 在 5 倍 Fmoc 氨 基 酸 、 DIC和Oxyma Pure（CarboMAX）⁵中進(jìn)行。使用肼的 DMF 溶液進(jìn)行 ODmab 基團(tuán)的脫保護(hù)。首尾環(huán)化反應(yīng)使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進(jìn)行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統(tǒng)中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進(jìn)行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

圖5： Poly N-Methyl Peptide

在配備有 PDA 檢測(cè)器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上分析肽， 該 檢 測(cè) 器 配 備 Acquity UPLC BEH C8 柱 （1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到 Waters 3100 Single Quad MS 用于結(jié)構(gòu)測(cè)定。在 Waters MassLynx 軟件上進(jìn)行峰分析。使用 (i) H2O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脫進(jìn)行分離。

結(jié)果

在 Liberty Blue 自動(dòng)微波肽合成儀上 CEM 7-mer 的微波增強(qiáng)固相合成產(chǎn)生了純度為 78% 的目標(biāo)肽（圖 6）。

圖6：CEM 7-mer 的UPLC色譜圖

在 LibertyBlue 自動(dòng)微波肽合成儀上的 Cyclorasin A的微波增強(qiáng)。

圖7：Cyclorasin A (Liberty Blue)的UPLC的色譜圖

Liberty PRIME 自動(dòng)微波肽合成儀上的 Cyclorasin A 微波增強(qiáng)。

圖8：Cyclorasin A (Liberty PRIME)的UPLC色譜圖

Liberty PRIME 自動(dòng)微波肽合成儀上的 Poly N-Methyl Peptide。

圖9：多聚N-甲基Peptide 的UPLC色譜圖

Liberty PRIME 自 動(dòng) 微 波 肽 合 成 儀 上 的 N-Methyl Cyclorasin Analog 的微波增強(qiáng)固相合成產(chǎn)生了純度為 66% 的目標(biāo)肽（圖10）。

圖10：N-甲基 CyclorasinAnalog的UPLC色譜圖

結(jié)論

使用自動(dòng)微波增 SPPS 可以快速有效地合成首尾環(huán)肽。此外，易于使用的 Liberty Blue 和 Liberty PRIME 軟件允許對(duì)肽序列進(jìn)行快速直接的編程。使用 Liberty Blue 肽合成儀在 2 小時(shí) 13 分鐘內(nèi)合成了純度為 78% 的 7 聚體環(huán)肽。在 Liberty Blue 上在 3 小時(shí) 1 分鐘內(nèi)以高純度 (75%) 合成了 Cyclorasin A 環(huán)肽。在 Liberty PRIME 上僅用了 2 小時(shí)就合成了相同的肽，純度很高 (75%)，浪費(fèi)大約 100 mL。在 Liberty PRIME 上，微波增強(qiáng)的 SPPS 可在 2 小時(shí) 5 分鐘內(nèi)以 66% 的純度合成了具有綜合挑戰(zhàn)性的 N-methyl cyclorasin analog 環(huán)肽。后，在 Liberty PRIME 上以 73% 的純度在 2 小時(shí) 12 分鐘內(nèi)制備出多聚 N-甲 基化 11 聚體肽。 

參考文獻(xiàn)

[1] Upadhyaya, P.;Qian, Z.; Selner, N. G.; Clippinger, S. R.; Wu, Z.; Briesewitz, R.; Pei, D. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015, 54 (26), 7602–7606. 

[2] White, A. M.; Craik, D. J. Expert Opin. Drug Discov. 2016, 11 (12), 1151–1163.

[3] Hurtley, S. M. Science. 2018, 361 (6407), 1084.4-1085. (4) Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. (5) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”