WB實驗的步驟較多,耗時均較長,且每步都影響其結果表現。我們將常見問題總結歸納,下面將對各問題進行分類總結,并對出現該現象的原因進行分析,給出相應的解決辦法。
無信號,沒有陽性條帶
WB實驗結果中常出現白板或者條帶無信號響應現象,我們針對出現該現象可能的原因主要從抗體,抗原,實驗操作和緩沖液幾方面進行分析。
1、抗體相關原因:
WB中所用到抗體包括一抗和二抗,在該問題上,兩個抗體方面可能存在的原因以及相對應的解決方法。
解決辦法:二抗選用不恰當,選擇與一抗相匹配的二抗類型,二抗需和一抗宿主的物種相同。無足夠量抗體結合目標蛋白,降低一抗稀釋度;使用效價高的一抗;延長抗體孵育時間;膜充分浸潤在液體中。
2、抗原相關原因
抗原即所需要檢測目的蛋白,其相關原因可能是未被一抗識別或者是抗原量不足引起。
解決辦法:一抗不識別待檢測的目的蛋白,參照數據庫對比抗原序列和蛋白序列,選擇合適一抗,確保會發生特異性反應,抗原量不足或降解,每條泳道上樣量不低于20~30ug,使用蛋白酶抑制劑并設置陽性對照。
實驗操作規范對于實驗結果也至關重要,且需要重復摸索。無條帶出現可能是目標蛋白未從膠轉移至膜上或者洗膜過度。
WB實驗結果中可能出現有目標蛋白條帶,但是目標條帶在膜上顏色較淺。該現象原因與無目標條帶較為相似,可能導致該現象的原因我們也從4個方面進行分析,并給出相應的解決方法。
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