1.通過代謝組全基因組關聯研究(mGWAS)鑒定出兩個酚酰胺生物合成基因簇
作者為研究番茄馴化中酚酰胺含量（及其遺傳基礎），對401個番茄品種進行代謝分析。發現大多數酚酰胺豐度下降（圖1A）。mGWAS揭示第11號染色體與diCou-Put和diCaf-Put相關，第7號染色體與FerCaf-Spd相關（圖1B、C）。第11號染色體上的SNP(sf1154946315)附近鑒定出8個控制酚酰胺含量的基因，包括酰基轉移酶、UDP-葡萄糖基轉移酶等（圖1B）。第7號染色體上圍繞顯著SNP(sf0703267875)發現4個基因，涉及酰基轉移酶、4-香豆酸CoA連接酶及MATE基因（圖1C）。這兩組共定位的基因可能代表番茄中調節酚酰胺的生物合成基因簇，分別稱為BGC11和BGC7。
為鑒定BGC11和BGC7中5個酰基轉移酶、2個4-香豆酸輔酶A連接酶和2個糖基轉移酶的生物學功能，克隆了這些候選基因的編碼DNA序列(CDSs)。SIAT1.1、SIAT1.2和SIAT1.3表現出以腐胺為酰基受體和香豆酰輔酶A為酰基供體的酰基轉移酶活性（圖1D）。其中SIAT1.2可催化雙酰基化（圖1D）。SIDH29、SICV86分別催化酰基亞精胺生成Caf-Spd、diCaf-Spd（圖1E）。在煙葉中，SI4CL1.1、1.2將香豆酸、咖啡酸分別轉化為相應的輔酶A（圖1F、G）。SIUGT93U2、93U3將Fer-Put轉化為(Fer-O-Hex)-Put（圖1H）。此外，SIC3H被證實能夠生成咖啡酸（圖1I）。
最后，進行了亞細胞定位分析以驗證SIDTX29是否作為番茄中的酚酰胺轉運體。在過表達SIDTX29的轉基因番茄植株(SIDTX29-OE)中觀察到了轉運活性（圖1J）。與野生型(WT)植物相比，SIDTX29-OE株系對Spd的敏感性更強，并且使用8D標記的Spd和液相色譜-質譜(LC-MS)證明其對Spd吸收活性也更高（圖1K）。以上結果表明，BGC11和BGC7是兩個新發現的酚酰胺生物合成基因簇。
圖1|酚酰胺生物合成基因簇BGC11
和BGC7的鑒定
2. BGC11和BGC7對番茄中酚酰胺多樣性的貢獻
作者為探究BGC11和BGC7核心酶在番茄中的功能，構建了過表達SIAT1.1、SIAT1.2、SIAT1.3、SIDH29和SICV86的轉基因番茄株系。代謝物分析顯示，SIAT1.1/1.3-OE株系中單酰基化Put衍生的酚酰胺增加（圖2A-B），而二酰基化的Put衍生酚酰胺在SIAT1.2-OE株系中過度積累（圖2C）。隨后研究發現CRISPR-Cas9生成的SIAT1.2突變株系(SIat1.2-CR)中二酰化酚酰胺減少，尤其diCou-Put減少近3倍（圖2D），表明BGC11增強了Put衍生酚酰胺多樣性。類似地，SIDH29-OE株系中單酰基化Spd衍生酚酰胺增加（圖2E），而SICV86-OE株系中二酰基化Spd衍生酚酰胺積累更多（圖2F），再次表明了Spd衍生酚酰胺的多樣化。
為研究轉運蛋白SIDTX29如何影響酚酰胺代謝，進一步使用LC-MS測定了酚酰胺積累。結果表明SIDTX29-OE品系中Caf-Spd、Fer-Spd和diCaf-Spd積累明顯增加（圖2G）。BGC7的四個基因共表達使煙葉中的Caf-Spd含量增加了35.4倍（圖2H）。單獨或共表達也導致Caf-Spd的積累顯著增加（圖2H）。研究表明BGC11與Put衍生的酚酰胺，BGC7與Spd衍生酚酰胺的生物合成與修飾、運輸的關系（圖2I）。以上發現強調了BGC11和BGC7這兩個基因簇在番茄酚酰胺多樣性中發揮的關鍵作用。
3. SlMYB13直接正向調控BGC11和BGC7中的基因表達，以促進酚酰胺的積累
接下來，作者通過分析兩個BGC基因簇的表達譜，發現它們主要在根、花、葉、莖、果實中高度表達。熒光定量PCR 驗證了二者的同步表達（圖3A）。共表達網絡分析表明SIMYB13與BGC7和BGC11在花、根中的表達模式的相關性較強。此外，SIMYB13和基因簇均因干旱脅迫和脫落酸(ABA)處理而上調，表明存在脅迫響應調節機制（圖3B和3C）。
為了描述SIMYB13與BGC11和BGC7的12個基因之間的相互調控作用，進一步通過酵母單雜交試驗證實了SIMYB13與基因啟動子的直接相互作用（圖3D）。SIMYB13-OE系顯示BGC7和BGC11基因表達增加，Put衍生和Spd衍生的酚酰胺水平更高（圖3E）。相反，SImyb13-CR系顯示12個基因的表達減弱，且酚酰胺含量減少（圖3F）。綜上所述，SIMYB13正向調控番茄中的BGC11和BGC7，突出了其在促進酚酰胺積累中的作用。
4. BGC11、BGC7和SIMYB13通過促進番茄中酚酰胺的積累提高耐旱性
在進一步的研究中，作者使用表達SIMYB13和核心BGC基因的轉基因品系開展干旱脅迫實驗。結果表明SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE、SICV86-OE和SIMYB13-OE品系比WT植株更耐旱，其中SIAT1.2-OE特別耐旱（圖4A和4B）；相比之下，SImyb13-CR系比WT植株對干旱脅迫更敏感（圖4C）。在水分充足或干旱脅迫條件下，SIat1.2-CR系和WT植株之間沒有顯著差異（圖4D-4F）。SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE系在干旱條件下比WT植株表現出更高的存活率和更高的相對含水量，而SImyb13-CR系則表現出相反的模式（圖4E和4F）。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定和丙二醛(MDA)積累試驗表明，與WT植物相比，SIAT1.2-OE和SIMYB13-OE植物的活性氧(ROS)清除能力增強，MDA積累減少（補充圖）。這些結果表明BGC11、BGC7和SIMYB13可以增強番茄的耐旱性。
作者通過分析轉基因植株在干旱脅迫下的ABA水平發現，SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE品系的ABA積累高于WT，而SImyb13CR品系中ABA積累較少（圖4G）。通過RT-qPCR進行檢測，結果表明，干旱脅迫后，ABA合成和信號轉導相關基因在過表達品系中表達增加，而在SImyb13-CR中減少（圖4H-I）。SIat1.2CR與WT在ABA含量或基因表達上無顯著差異。因此，BGC11、BGC7和SIMYB13可以影響ABA含量。
進一步分析結果表明，干旱條件下SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE等植株中酚酰胺（如Fer-Put等）積累高于WT，而SImyb13-CR較低（圖4J）。外源Fer-Put處理WT植物后，ABA含量顯著升高（圖4K），且相關基因表達也增加（圖4L-M）。這表明酚酰胺積累（受BGC11、BGC7和SIMYB13調控）通過增強ROS清除能力和增加ABA來增強番茄耐旱性。
圖4|BGC11、BGC7和SIMYB13在
番茄耐旱性中的作用
補充圖|WT、SIAT1.2-OE和
SIMYB13-OE轉基因植株中ROS
積累和ABA相關基因表達比較
5. 番茄馴化和改良過程中BGC11、BGC7和SIMYB13的自然變異
接下來，為探究BGC11、BGC7和SIMYB13的進化歷史，作者比較了三個番茄亞組之間的核苷酸多樣性(π)。在變異分析中，作者在SIMYB13的CDS區域內發現了一個與Fer-Put、diCou-Put和diCaf-Spd相關的非同義突變。基于該變異，番茄種群被分為兩個單倍型組，即SIMYB13-THapA和SIMYB13-GHapB。SIMYB13-GHapB的Fer-Put(P = 2.36×10-9)，diCou-Put（P = 3.15×10-5）和diCaf-Spd（P = 2.15×10-9）濃度顯著高于SIMYB13-THapA，且在番茄馴化和改良過程中頻率逐漸降低（圖5A）。
同時，作者在煙葉中瞬時表達了SIMYB13-THapA和SIMYB13-GHapB，并發現SIMYB13-GHapB中酚酰胺的積累量更大（圖5B）。此外，表達這兩種單倍型的SIMYB13-OE株系比WT植株表現出更強的耐旱性；特別是SIMYB13-GHapB，在干旱條件下保持了更強的ROS清除能力以及更低的MDA水平（圖5C和5D）。以上結果表明，SIMYB13-GHapB可以調節酚酰胺的積累，并在番茄馴化和改良過程中經歷了負向選擇。
基于上述結果，作者將六個基因單倍型組合為HapA、HapB和HapC三組。結果顯示，HapB品種的酚酰胺積累量遠高于HapA（圖5F、G），耐旱性也更強（圖5H）。經RT-qPCR和代謝組學分析證實，HapB中這些基因的轉錄本上調，酚酰胺積累量增加（圖5I）。以上發現強調了HapB單倍型與酚酰胺含量增加的關聯，HapB的消耗可能是導致番茄耐旱性降低的因素之一。
圖5|番茄馴化過程中對BGC11、BGC7
和SIMYB13的逐步篩選
為了進一步探索BGC11和BGC7基因的進化歷史，作者對30個具有進化代表性的物種進行了比較基因組分析。分析表明，發現CPA基因在藻類中存在且保守，而4CL、C3H和UGT基因源于陸生植物祖先。BGC11和BGC7核心基因僅存在于陸生植物中。BGC11和BGC7基因聚集在茄科植物中，馬鈴薯和番茄基因共線性較強。這些發現突出了酚酰胺BGCs在植物適應陸地環境及茄科植物保護中的重要性（圖6）。
考慮到物種的系統發育和全基因組復制的歷史，作者提出了一個進化模型來解釋BGC11和BGC7基因簇的起源。1910萬年前基因組重排影響BGC11，620萬年前串聯重復影響BGC7。這些發現表明，基因簇的形成和多樣化依賴于結構變異和基因得失。在番茄馴化中，BGC11、BGC7和SIMYB13的HapB受負向選擇，導致酚酰胺含量下降，影響耐旱性（圖7）。
圖7|兩個馴化相關基因簇
（BGC11和BGC7）和SIMYB13
調節番茄耐旱性的示意圖
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