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凝膠過濾填料 瓊脂糖凝膠4FF
貨號 :S9180
規(guī)格 :100mL
產(chǎn)品 簡介 :
瓊脂糖凝膠FF是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑,所以將這類物質(zhì)偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上,可以從各種來源的樣品中一步純化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽釋放酶、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。
苯甲脒瓊脂糖凝膠由于應用新的活化方法所以流速高, 非特異吸附少, 而且填料粒度均勻,所以分離效果好,是純化絲氨酸蛋白酶類適合的填料。
親和填料 特征 :
特點 | 載量大,分辨率好,流速高,使用方便。 |
基質(zhì) | 4%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠 |
配基 | 苯甲脒 |
配基密度 | 7µmol /ml |
吸附載量 | 13 mg胰蛋白酶/ml |
填料的顆粒大小 | 45-165µm |
大流速 | 300cm/h |
pH范圍 | 3-10,在位清洗時pH范圍可到2-11 |
保存溫度 | +4~8℃ |
保存液體 | 20%乙醇 |
適用范圍 :
一步從各種樣品中純化絲氨酸蛋白酶類物質(zhì)。
應用實例:
實驗名稱:苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF分離尿激酶。
實驗步驟:
(1)苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF裝柱,1.6×20m,柱床體積為10ml
(2)用緩沖液1平衡2-5個床體積,流速為2ml/min
(3)取尿激酶粗品200mg溶解在20ml的緩沖液1中,用0.45µm的濾膜過濾,上樣,流速
為1ml/min
(4)用緩沖液1再洗2-5個床體積,流速為2ml/min
(5)后緩沖液2進行洗脫,流速為2ml/min,收集洗脫峰,用SDS-PAGE純化后的效果。
(6)用純水洗5個柱床體積,然后分別用100mM,pH8.0Tris-HCl緩沖液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含1M NaCl交替洗滌3次,再用純水洗3個柱床體積,然后再用20%的乙醇流洗3個柱床體積,流速為2ml/min,柱子置于+4~8℃環(huán)境中保存。
(7)色譜圖見圖1,SDS-PAGE結(jié)果見圖2。 緩沖液組成:
緩沖液1:100mM pH7.4的PBS緩沖液;緩沖液2:100mM醋酸緩沖液,pH4.0。
也可以用這個填料特異去除各種融合蛋白酶切后的絲氨酸蛋白酶,例如凝血酶以及胰蛋
白酶類蛋白酶。例如去除凝血酶上樣緩沖液為:50mM pH7.4的PBS緩沖液含0.15M NaCl,洗脫緩沖液為:50mM pH7.4的PBS緩沖液含1M NaCl。
SDS-PAGE流程:
(1)BSA法測量樣品蛋白濃度;
(2)根據(jù)測定樣品的蛋白濃度,算出5-10µg/孔所需的體積;
(3)向1.5ml EP管中加入含5-10µg蛋白的樣品溶液,若體積小于10µL,則加20mM PBSpH7.4補足10µl;若體積大于10µl,則要加入1ml無水乙醇,-20℃下濃縮1h;
(4)取濃縮樣品10000rpm離心15min,除去上清,37℃烘箱10min去除殘余的乙醇;
(5)在樣品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10µl,100℃下10min。取出后用冷卻30s,4000rpm離心1s;
(6)點樣,電泳。
應用的注意事項 :
1 色譜柱裝填
1、所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣,液體好做脫氣處理。
2、在柱子下端加入蒸餾水,以除去柱子中的空氣,關(guān)閉柱子出口,在柱內(nèi)保留少量的
蒸餾水。
3、將瓊脂糖凝膠連續(xù)倒入柱子時,要用玻璃棒的緊靠柱子內(nèi)壁引流,以減少氣泡的產(chǎn)
生,讓填料先自然沉降。
4、柱壓不超過0.3MPa,如果裝柱系統(tǒng)中無法測柱壓,則控制流速高于300cm/h,但是在使用中一般只用大流速的75%。
2 蛋白的結(jié)合
平衡緩沖液可以采用如下配方:100mM pH7.4的PBS緩沖液,0.1M NaCl,pH8.0。上樣完畢后,繼續(xù)用平衡緩沖液洗柱子,直到基線平穩(wěn)。
3 蛋白的洗脫
(1)洗脫可以采取特異性或者非特異性洗脫。
(2)特異性洗脫可以用目標分子的競爭劑,對氨基苯甲脒的抑制劑。對非特異性洗脫
而言,可以選用以下幾種方法:
a 改變離子強度,通常加入1M的NaCl,必要的話可以采用階段洗脫或線性梯度洗脫。
b 改變pH,可采用階段洗脫洗脫或線性梯度洗脫來達到目的。
c 降低洗脫緩沖液的極性。如可以在洗脫緩沖液中加入10%的二氧六環(huán)等。
d 使用變性劑。如在洗脫緩沖液中加入尿素、鹽酸胍等。
再生、清洗:
1 再生
用純水洗5個柱床體積,然后分別用100mM,pH8.0Tris-HCl緩沖液含1M NaCl和
100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含1M NaCl交替洗滌3次,再用水洗3個柱床體積,然后再用20%的乙醇流洗3個柱床體積,流速為2ml/min,柱子置于+4~8℃環(huán)境中。
如果在色譜操作過程中用到了變性劑或者去污劑,也可以用上述方法洗柱子。
2 清洗
在應用中,柱子上結(jié)合的一些物質(zhì)如變性蛋白和脂質(zhì)等不能通過再生過程去除,這種
情況下,可以用去污劑如0.1%Triton X-100在37℃洗柱子1min。之后立即用5個床體積的平衡液洗柱子。
保存:
在20%乙醇中,4℃下長期保存。
特別注意 :
上樣之前 , 樣品必須去除色素 , 否則色素會被吸附到填料上 , 影響填料的正常使用
凝膠過濾填料 瓊脂糖凝膠4FF訂購說明:
1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨,一般情況下都能訂貨當日發(fā)貨。
2、部分非常用產(chǎn)品,需提前1-2日預訂,海外期貨則需要提前3-6周預訂。
3、部分產(chǎn)品價格會因貨期、批次等因素發(fā)生變化,若有變動以訂貨當日新價格為準。
4、每日訂單截止時間為16點整,部分城市可到17點整,因超過截止時間造成當日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
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1、極低溫產(chǎn)品:極低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來,再用泡沫盒密封,膠帶層層粘住泡沫盒,放入索萊寶的箱子,然后交付給合作快遞,安全快速高效放心的送客戶的手中,保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,為您的實驗保駕護航。
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