目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC2245-100T/96S果糖-1,6-二磷酸含量檢測試劑盒 微量法
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
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分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/96S |
貨號 | BC2245 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
主要用途 | 測定意義:果糖1,6-二磷酸是機(jī)體內(nèi)的高能代謝物和代謝調(diào)控劑,是糖酵解途徑的重要 |
果糖-1,6-二磷酸(FDP)含量檢測試劑盒說明書
微量法
注意:本產(chǎn)品試劑有所變動,請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號:BC2245
規(guī)格:100T/96S
產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體×2支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體7 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 2-8℃保存 | |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 試劑二:臨用前取一支加入0.15 mL蒸餾水,充分溶解后待用,用不完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融;
2、 標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入1176 μL 蒸餾水充分溶解,配制成50 μmol/mL果糖-1,6-二磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,2-8℃可以保存4周。
產(chǎn)品說明:
果糖1,6-二磷酸(fructose-1,6-diphosphate, FDP)是糖酵解過程中的一種重要的中間產(chǎn)物,對多種酶具有調(diào)節(jié)作用,具有改善細(xì)胞能量代謝、增加能量利用、抗心律失常及抗組織過氧化等作用,廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)藥。
醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸裂解,產(chǎn)物與2,4-二* 苯 肼在酸性介質(zhì)中反應(yīng)生成2,4-二*苯腙,在堿性溶液中呈紅棕色,在540 nm處有特征吸收峰。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫臺式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰、蒸餾水和EP管。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
組織:按照質(zhì)量(g):提取液一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴勻漿后于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
血清(漿)等液體:取100μL液體加入1mL提取液一,4℃ 12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
注:提取液二需緩慢加入,加入后會產(chǎn)生大量氣泡,建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。
二、測定步驟
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至540nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。
2、 將50µmol/mL的果糖-1,6-二磷酸標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表:
序號 | 稀釋前濃度(μmol/mL) | 標(biāo)準(zhǔn)液體積(µL) | 蒸餾水體積(µL) | 稀釋后濃度μmol/mL) |
1 | 50 | 30 | 930 | 1.5625 |
2 | 1.5625 | 200 | 200 | 0.78125 |
3 | 0.78125 | 200 | 200 | 0.39 |
4 | 0.39 | 200 | 200 | 0.2 |
5 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4、 樣本測定:(在1.5 mL離心管或96孔板中操作)
試劑名稱(µL) | 對照管 | 測定管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
樣本 | 20 | 20 | - | - |
蒸餾水 | - | - | 20 | - |
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | - | - | - | 20 |
試劑一 | 44 | 40 | 44 | 40 |
試劑二 | - | 4 | - | 4 |
充分混勻,37℃準(zhǔn)確反應(yīng)2 h | ||||
試劑三 | 40 | 40 | 40 | 40 |
充分混勻,37℃準(zhǔn)確反應(yīng)20 min | ||||
試劑四 | 100 | 100 | 100 | 100 |
充分混勻,37℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min | ||||
于微量玻璃比色皿/96孔板中測定540nm處吸光值A,分別記為A對照管、A測定管、A空白管和A標(biāo)準(zhǔn)管。計(jì)算ΔA=A測定管-A對照管,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。(空白管和標(biāo)曲只需檢測1-2次) |
三、FDA含量計(jì)算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸,其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b,將ΔA帶入方程得到x(µmol/mL)。
2、FDP含量的計(jì)算:
(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算
FDP含量(µg/g 質(zhì)量)=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=403.75x÷W
(2)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
FDP含量(µg/104 cell)=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×N)=403.75x÷N
(3)按液體體積計(jì)算
FDP含量(µg/mL)=x×(V上清+V提取液二)×M÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]=4441.25x
V上清:提取時(shí)上清液體積,0.8mL;V提取液二:提取液二的體積,0.15mL;V提取液一:提取液一的體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g;M:果糖-1,6-二磷酸分子質(zhì)量,340;V液體:液體樣本體積,0.1mL;N:細(xì)胞數(shù)量,以萬計(jì)。
注意事項(xiàng):
當(dāng)ΔA測定大于0.5時(shí),建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定,計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
相關(guān)系列產(chǎn)品:
BC2270/BC2275 果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FBA)活性檢測試劑盒
BC2250/BC2255 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)活性檢測試劑盒
果糖-1,6-二磷酸含量檢測試劑盒 微量法 果糖-1,6-二磷酸含量檢測試劑盒 微量法
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