目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>> BC3830Caspase-3活性測定試劑盒 比色法
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
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分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 20T/50T/100T |
貨號 | BC3830 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
主要用途 | Caspase-3活性測定 |
Caspase-3活性檢測試劑盒說明書
比色法
貨號:BC3830
規格:20T、50T、100T
產品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱/規格 | 20T | 50T | 100T | 保存條件 |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 液體20 mL×1瓶 | 液體25 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑二 | 液體30 mL×1瓶 | 液體60 mL×1瓶 | 液體120 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體0.25 mL×1支 | 液體0.55 mL×1支 | 液體0.55 mL×2支 | -20℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 液體1 mL×1支 | 液體1 mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制:
試劑一:分裝-20℃保存。
試劑二:分裝-20℃保存。
標準品:pNA標準溶液,5 mmol/L。標準溶液在4℃條件下為渾濁狀態,溶解即可變為澄清狀態,不影響使用。
標準品稀釋液配制:取9 mL試劑一加入1 mL試劑二,充分混勻待用。(也可按照試劑一:試劑二=9:1的比例,自行配制)。
產品說明:
Caspase是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族,包含10多個成員。Caspase-3是凋亡過程中最主要的終末蛋白酶,也是研究最多caspase;它激活pro-caspase-2,6,7,9特異水解多種關鍵凋亡蛋白如 PARP,介導染色質固縮、凋亡小體生成、核 DNA 斷裂。測定原理基于Caspase-3 特異水解多肽底物 DEVD-pNA (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide),釋放的游離硝 基苯胺 pNA在405 nm有最大吸收峰。采用可見光光度比色法測定 pNA 而得到 Caspase活性。適用于檢測哺乳動物組織、細胞Caspase-3活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1、培養細胞:先收集細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細胞數量(約106個)加100 μL試劑二(若裂解不充分可提高至150-200 μL),震蕩重懸沉淀,置冰上靜置15 min,4℃,15000g離心10-15min,取上清置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):試劑二體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1 g組織,加入1 mL試劑二),冰浴研磨或充分剪碎,置冰上靜置15 min,4℃,15000g離心10-15min,取上清置冰上待測。
二、測定步驟
可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上,調節波長至405nm,蒸餾水調零。
臨用前用標準品稀釋液將5 mmol/L pNA標準品稀釋至200、100、50、25、12.5、0 μmol/L的標準溶液待用。
樣本測定(在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 空白管 | 標準管 |
試劑一 | 40 | 40 | |
樣本 | 50 | ||
試劑二 | 50 | ||
試劑三 | 10 | 10 | |
標準溶液 | 100 | ||
混勻,蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37℃孵育60-120分鐘。發現顏色變化比較明顯時即可測定405nm處吸光值。如果顏色變化不明顯,可以適當延長孵育時間,甚至可以孵育過夜。空白管只需做1-2次。計算ΔA測定=A測定管-A空白管。 | 立即測定405nm下吸光度 |
三、Caspase-3活性計算
1. 標準曲線的建立:
根據標準管的濃度(x,μmol/L)和ΔA標準(y,減去濃度為0的空白管)做標準方程。將ΔA測定代入標準方程得到x(μmol/L)。
2. 按酶活性增加百分比計算
Caspase-3活性增加百分比=(實驗處理組A測定-A空白管)/(實驗對照組A測定-A空白管)×100%
該方法簡單可靠,可粗略反應酶活性情況。
3. 按酶活計算
參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當底物飽和時,在37℃一個小時內可以剪切1nmol pNA底物產生1nmol游離 pNA的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase酶活性。
Caspase-3活性(U/mg prot)=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×103=2x÷Cpr÷T
V反總:反應體系總體積,0.1mL=10-4L;V樣:加入的樣本體積,0.05mL;T:反應時間,h;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;103:單位換算系數,1μmol =103nmol。
注意事項:
1、由于試劑二中含有還原劑(DTT),建議將樣品用水稀釋2倍后,用Bradford法測定蛋白濃度,以降低DTT對蛋白濃度測定的干擾。不建議使用BCA法測定蛋白濃度。
2、Caspase活性測定值低最常見的原因是細胞未發生凋亡或細胞量太少,其次是觀測時間不恰當。誘導凋亡時,并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高。建議設置不同劑量和時間點如0、2、4、8、16、24小時,以檢測最佳的觀察點。
3、所測樣本的值高于標準曲線上,可用試劑二稀釋樣本后重新測定。
4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC孵育,肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2,此時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應或過夜,但酶活性較強時,孵育時間過長將導致反應失去線性關系。
相關發表文獻:
[1] Wang B , Wang K , Jin T , et al. NCK1-AS1 enhances glioma cell proliferation, radioresistance and chemoresistance via miR-22-3p/IGF1R ceRNA pathway[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2020, 129:110395.
[2] Wang Z , Xu J H , Mou J J , et al. Novel ultrastructural findings on cardiac mitochondria of huddling Brandt's voles in mild cold environment[J]. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A Molecular & Integrative Physiology, 2020, 249:110766.
[3] Wang Z , Xu J H , Mou J J , et al. Novel ultrastructural findings on cardiac mitochondria of huddling Brandt's voles in mild cold environment[J]. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A Molecular & Integrative Physiology, 2020, 249:110766.
參考文獻:
Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.
Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.
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