目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>脂肪酸代謝系列>> BC1075-100T/96S丙酮酸脫羧酶活性檢測試劑盒 脂肪酸代謝
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
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分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/96S |
貨號 | BC1075 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
主要用途 | 丙酮酸脫羧酶(PDC)活性檢測 |
丙酮酸脫羧酶(PDC)活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意:本產品試劑有所變動,請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號:BC1075
規格:100T/96S
產品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一A | 液體14 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一B | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑一C | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑二A | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二B | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑二C | 粉劑×1支 | |
試劑三 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 提取液:內含不溶物,使用前搖勻。
2、 試劑一的配制:臨用前配制,將試劑一B、試劑一C加入到試劑一A中并充分溶解。-20℃分裝保存,可保存1個月,避免反復凍融。
3、 試劑二B:臨用前加入0.3mL蒸餾水溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復凍融。
4、 試劑二C:臨用前加入1mL蒸餾水溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復凍融。
5、 試劑二的配制:臨用前配制,取1.305mL試劑二A、0.12mL試劑二B、0.075mL試劑二C混合(共1.5mL,約75T),現用現配。
產品說明:
PDC主要存在于酵母中,是乙醇發酵的關鍵酶之一,催化丙酮酸脫羧生成乙醛。
PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,添加乙醇脫氫酶(ADH)來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+;NADH在340nm有吸收峰,而NAD+沒有;通過測定340nm光吸收下降速率,來計算PDC活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品
臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養箱、微量石英比色皿/ 96孔UV板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1、細胞或細菌樣本的制備:先收集細胞或細菌樣本到離心管內,棄上清,按照每500萬細胞或細菌加入1mL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率200W,超聲3s,間隔10s,重復30次)。16000g,4℃離心20min,取上清,置冰上待測。
2、組織樣本:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液,冰上充分研磨。16000g,4℃離心20min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣本:直接檢測。
二、操作步驟
1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,紫外分光光度計用蒸餾水調零。
2、 根據樣本數取適量試劑一、試劑三37℃提前預熱30min.
3、 操作表:(在微量石英比色皿/ 96孔UV板中按下表順序加入試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 空白管 |
試劑一 | 100 | 100 |
試劑三 | 60 | 60 |
試劑二 | 20 | 20 |
樣本 | 20 | - |
蒸餾水 | - | 20 |
迅速混勻后于340nm比色,記錄10s和70s的吸光值,測定管的記為A1和A2,空白管的記為A3和A4,計算ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)。(空白管只需做1-2次)
三、PDC活性計算
A.使用微量石英比色皿測定的計算:
1、血清(漿)PDC活力的計算:
單位定義:在37℃條件下,每毫升血清(漿)在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/mL)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷V樣本÷T=1.61×ΔA
2、 按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:在37℃條件下,每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷(V樣本×Cpr)÷T=1.61×ΔA÷Cpr
3、 按樣本質量計算:
單位定義:在37℃條件下,每g組織質量在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/g 質量)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷ (W÷V提取×V樣本)÷T=1.61×ΔA÷W
4、 細菌或細胞中PDC活力的計算:
單位的定義:在37℃條件下,每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘催化1μmol的NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/104 Cell)= ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷(V樣本÷V提取×N)÷T =1.61×ΔA÷N
ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應體系總體積,2×10-4L;V樣本:加入反應體系中上清液體積,0.02mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定;T:反應時間,1min;W:樣本質量,g;V提取:提取液體積,1mL;N:細菌或細胞總數,以萬計;106:單位換算系數,1mol=106μmol。
B.使用96孔UV板測定的計算:
1、血清(漿)PDC活力的計算:
單位定義:在37℃條件下,每毫升血清(漿)在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/mL)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷V樣本÷T=2.68×ΔA
2、按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:在37℃條件下,每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷(V樣本×Cpr)÷T=2.68×ΔA÷Cpr
3、按樣本質量計算:
單位定義:在37℃條件下,每g組織質量在反應體系中每分鐘催化1μmol NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/g 質量)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷ (W÷V提取×V樣本)÷T=2.68×ΔA÷W
4、細菌或細胞中PDC活力的計算:
單位定義:在37℃條件下,每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘催化1μmol的NADH氧化定義為一個酶活力單位。
PDC(U/104 Cell)= ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷(V樣本÷V提取×N)÷T =2.68×ΔA÷N
ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,0.6cm;V反總:反應體系總體積,2×10-4L;V樣本:加入反應體系中上清液體積,0.02mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定;T:反應時間,1min;W:樣本質量,g;V提取:提取液體積,1mL;N:細菌或細胞總數,以萬計;106:單位換算系數,1mol=106μmol。
注意事項:
1、 實驗時,試劑二和樣本在冰上放置,以免變性和失活。
2、 比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃,可以取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水,將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中;或者使用浮漂固定比色皿放入水浴鍋;或者使用恒溫培養箱等。
3、 最好兩個人同時做此實驗,一個人比色,一個人計時,以保證實驗結果的準確性。使用96孔板測定時不推薦同時測多個樣本。
4、 如果1分鐘變化值較小可延長反應時間,同時注意修改計算公式。
實驗實例:
1、 取0.1g綠蘿葉加入1mL提取液進行勻漿研磨,取上清,之后按照測定步驟操作,用微量石英比色皿測得計算ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)=(0.9557-0.9299)-(0.7363-0.7301)=0.0196,按樣本質量計算酶活得:
PDC(U/g 質量)=1.6×ΔA÷W=1.6×0.0196÷0.1=0.3136 U/g 質量。
2、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL提取液進行勻漿研磨,取上清用蒸餾水稀釋40倍后按照測定步驟操作,用微量石英比色皿測得計算ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)=(0.703-0.468)-(0.7363-0.7301)=0.2288,按樣本質量計算酶活得:
PDC(U/g 質量)=1.6×ΔA÷W=1.6×0.2288÷0.1×40(稀釋倍數)=146.432 U/g 質量。
相關發表文獻:
[1] Chong Li,Shi Gao,Xiaotong Li,et al. Efficient metabolic evolution of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production using a glucose-based medium in an in situ fibrous bioreactor under low-pH condition. Biotechnology for Biofuels. August 2018;(IF5.452)
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