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NADP磷酸酶（NADPase）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號: BC1110
規格: 50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：用時加入1.5 mL試劑一充分溶解備用，現配現用。

2. 試劑三：用時加入20 mL雙蒸水，溶解后2-8℃可保存一周。

3. 試劑四：用時加入20 mL雙蒸水，溶解后2-8℃可保存一周。

4. 標準品：10 mmol/L 標準磷貯備液。將標準品20倍稀釋，即取 0.5 mL標準液加9.5 mL蒸餾水，充分混勻，配制成0.5 μmol/mL標準磷應用液。

5. 定磷試劑的配制：按H₂O：試劑三：試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷試劑根據實驗用量現用現配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
產品說明：
NADPase主要存在于植物組織中，是生物體內催化NADP⁺降解為NAD⁺的酶，與NADK一起調控NAD和NADP之間的平衡。
NADPase能夠催化NADP⁺水解為NAD⁺和無機磷的反應，通過測定無機磷的量來測定NADPase活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、1mL玻璃比色皿、勻漿器/研缽和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件

注意事項：

1. 此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格，要沒有一點磷，若試管放過磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來水沖，最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測成敗的關鍵。

2. 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。

實驗實例：

1. 取0.1肝加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.410-0.385=0.025，ΔA標準=A標準-A空白=0.365-0.005=0.360，按樣本質量計算酶活得：NADPase (U/g質量)=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W=0.125×0.025÷0.360÷0.1=0.087 U/g質量。

2. 取0.1g狗尾巴草（塊根)加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.510-0.107=0.403，ΔA標準=A標準-A空白=0.365-0.005=0.360，按樣本質量計算酶活得：NADPase (U/g質量) =0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W=0.125×0.403÷0.360÷0.1=1.399 U/g質量。

參考文獻：

1. Kawai S, Mori S, Mukai T, et al. Cytosolic NADP phosphatases I and II from Arthrobacter sp. strain KM: implication in regulation of NAD⁺/NADP⁺ balance[J]. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms, 2004, 44(3): 185-196.

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