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一氧化氮合成酶分型（TNOS、iNOS、cNOS）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5695

規格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液二：為易揮發試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；

2. 試劑二：試劑放于瓶內玻璃瓶內，臨用前加入6mL緩沖液，-20℃分裝可保存4周，避免反復凍融；

3. 試劑三工作液：臨用前根據樣本量按照試劑三：緩沖液=2μL：198μL（0.2mL，10T）的比例配制，現用現配；

4. 試劑四：臨用前加入0.6mL緩沖液，-20℃分裝可保存4周，避免反復凍融；

5. 試劑五：臨用前加入1.2mL緩沖液，-20℃分裝可保存4周，避免反復凍融；

6. 工作液：臨用前根據樣本數量按照試劑一：試劑二：試劑三工作液：試劑四=0.2mL：0.5mL：0.2mL：0.05mL（0.95mL，10T）的比例配制工作液，現用現配；

7. 試劑八工作液：臨用前根據樣本數量按照試劑八：緩沖液=5μL：225μL（0.23mL，23T）的比例配制，現用現配；

8. 顯色液：臨用前根據樣本數量按照顯色液A液：顯色液B液=1:1充分混勻，現配現用；

9. 標準品：10μmol/mL亞硝*鈉。臨用前取10μL 10μmol/mL亞硝*鈉標準液，加入990μL蒸餾水，配制成0.1μmol/mL亞硝*鈉標準液，現配現用。

產品說明：

一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase，NOS，EC 1.14.13.39，此試劑盒后寫為總NOS（TNOS））是生物體

內催化L-精*酸合成NO的一類酶，主要存在于血管平滑肌、巨噬細胞、內皮細胞、神經細胞、肝細胞、腎小球膜細胞等各種細胞中。根據其酶活性對鈣離子的依賴性不同，分為結構型NOS（constitutive NOS，cNOS）和損傷誘導型NOS（inducible NOS，iNOS），前者需要一定濃度的鈣離子方可激活，后者不依賴于外源鈣離子。

NOS催化L-精*酸、分子氧和NADPH，生成NO和NADP⁺，NO在水溶液中極易氧化生成NO₂^-和NO₃^-。在酸性條件下，NO₂^-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算得到NOS活性大小。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、恒溫水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：建議稱取0.2g樣本，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二，冰浴勻漿后，于4℃，12000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細菌/細胞樣本：建議1000萬細菌/細胞加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二，冰浴超聲破碎（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間5min），然后于4℃，12000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

3. 液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

注：可根據樣本量將提取液一和提取液二按照0.98mL：0.02mL的比例混勻后進行樣本前處理。

二、 測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至550nm，分光光度計蒸餾水調零。

2．在1.5mL EP管按下表順序加樣：

三、NOS活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/mg prot）=（ΔA測定1÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T×F

=1.67×ΔA測定1÷ΔA標準÷Cpr×F

（2）iNOS活性（U/mg prot）=（ΔA測定2÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T×F

=1.67×ΔA測定2÷ΔA標準÷Cpr×F

（3）cNOS活性（U/mg prot）=總NOS活性- iNOS活性

2. 按樣本質量計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/g 質量）=（ΔA測定1÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=1.67×ΔA測定1÷ΔA標準÷W×F

（2）iNOS活性（U/g 質量）=（ΔA測定2÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=1.67×ΔA測定2÷ΔA標準÷W×F

（3）cNOS活性（U/g 質量）=總NOS活性- iNOS活性

3. 按細菌/細胞數目計算

單位的定義：每10⁶個細菌/細胞每分鐘催化產生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/10⁶ cell）=（ΔA測定1÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（N×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=1.67×ΔA測定1÷ΔA標準÷N×F

（2）iNOS活性（U/10⁶ cell）=（ΔA測定2÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（N×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=1.67×ΔA測定2÷ΔA標準÷N×F

（3）cNOS活性（U/10⁶ cell）=總NOS活性- iNOS活性

4. 按液體體積計算

單位的定義：每mL液體每分鐘催化產生1nmol NO定義為一個酶活單位。

（1）TNOS活性（U/mL）=（ΔA測定1÷ΔA標準×C標準）×V樣÷V樣×10³÷T×F=1.67×ΔA測定1÷ΔA標準×F

（2）iNOS活性（U/mL）=（ΔA測定2÷ΔA標準×C標準）×V樣÷V樣×10³÷T×F=1.67×ΔA測定2÷ΔA標準×F

（3）cNOS活性（U/mL）=總NOS活性- iNOS活性

C標準：0.1μmol/mL；V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.06mL；V樣總：加入的提取液一和提取液二的總體積，1mL；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細胞或細菌數目，以10⁶計；10³：單位換算系數，

1μmol=10³nmol；T：反應時間，60min；F：樣本稀釋倍數。

注意事項：

1. NOS穩定性差，易變性失活，建議使用新鮮樣本實驗，如果不立即實驗，樣本需-20℃保存。

2. 試劑二配制好后，建議根據樣本量取出所需試劑二，剩余試劑二需盡快置于-20℃保存。

3. 如果?A測定小于0.005或測定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量或者延長第一步37℃反應時間后再進行測定；如果?A測定大于0.5，建議將樣本勻漿后的上清液用緩沖液適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取0.2047g新鮮小鼠肝臟樣本，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定1=A測定1-A空白=0.114-0.045=0.069，ΔA測定2=A測定2-A空白=0.072-0.045=0.027，ΔA標準=A標準-A空白=0.550- 0.045=0.505，按樣本質量計算得：

TNOS活性（U/g 質量）=1.67×ΔA測定1÷ΔA標準÷W = 1.115 U/g 質量

iNOS活性（U/g 質量）=1.67×ΔA測定2÷ΔA標準÷W = 0.436 U/g 質量

cNOS活性（U/g 質量）=總NOS活性- iNOS活性= 0.679 U/g 質量

2. 取60μL馬血清樣本，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定1=A測定1-A空白=0.066-0.045=0.021，ΔA測定2=A測定2-A空白=0.062-0.045=0.017，ΔA標準=A標準-A空白=0.550- 0.045=0.505，按液體體積計算得：

TNOS活性（U/mL）=1.67×ΔA測定1÷ΔA標準 = 0.069 U/mL。

iNOS活性（U/mL）=1.67×ΔA測定2÷ΔA標準 = 0.056 U/mL。

cNOS活性（U/mL）=總NOS活性- iNOS活性 = 0.013 U/mL。

參考文獻：

[1] List BM, Kl?sch B, V?lker C. et al. Characterization of bovine endothelial nitric oxide synthase as a homodimer with down-regulated uncoupled NADPH oxidase activity: tetrahydrobiopterin binding kinetics and role of haem in dimerization[J]. Biochemical Journal, 1997, 323(1): 159-165.

[2] Dawson J, Knowles RG. A microtiter-plate assay of nitric oxide synthase activity[J]. Molecular Biotechnology, 1999, 12(3): 275-279.

[3] F?rstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function[J]. European Heart Journal, 2012, 33(7): 829-837.

[4] Kazakov A, Hall R, Jagoda P. et al. Inhibition of endothelial nitric oxide synthase induces and enhances myocardial fibrosis [J]. Cardiovascular Research, 2013, 100(2):211-221.

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