目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>脂肪酸代謝系列>> BC5510-50T/48S線粒體乙醛脫氫酶活性檢測試劑盒 脂肪酸
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T/48S |
| 貨號 | BC5510 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
| 主要用途 | 線粒體乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測 |
線粒體乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC5510
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體35 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 2-8℃保存 | |
試劑四 | 液體1.8 mL×1支 | |
試劑五 | 液體7 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前取一瓶試劑二加入3mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
2、 試劑五：沸點低，在使用時保持低溫以保證正確的吸取量。用后及時封口。
3、 工作液：臨用前根據樣本數量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=550µL：100µL：20µL：30µL：100µL（800µL，1T）的比例配制工作液，現用現配。
產品說明：
線粒體乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）屬于乙醛脫氫酶蛋白家族，存在于很多組織，特別是肝臟組織內含量較高。該酶主要參與乙醇代謝過程的第二步，在線粒體內將乙醛氧化成羧酸，然后進入三羧酸循環，被分解，解除乙醛對生物體的毒害作用。另外，ALDH2也可作為酯酶參與硝*油的代謝途徑，是硝*油重要的生物活性劑。
ALDH2催化乙醛和NAD+轉化為乙酸和NADH，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可計算得到ALDH2的活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL提取液，在冰上用勻漿器或研缽進行快速勻漿（勻漿器可上下研磨30次左右）。
2. 4℃ 600 g離心10min（如需獲得純度更高的線粒體，可將此步離心速度改為1000g）。
3. 將上清液移至另一離心管中，4℃ 11000 g離心15min，棄上清，留沉淀。
4. 在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復15次），用于ALDH2活性測定，若用蛋白濃度計算，取20μL用于蛋白含量測定。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 工作液37℃預熱20min。
3、 操作表：
試劑名稱（µL） | 空白管 | 測定管 |
樣本 | - | 200 |
蒸餾水 | 200 | - |
工作液 | 800 | 800 |
在1mL石英比色皿中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測定1min時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或培養箱反應30min，拿出迅速擦干測定31min時的吸光值A2，計算ΔA測定=A2測定-A1測定，ΔA空白=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA測定-ΔA空白。空白管只需做1-2次。 | ||
三、ALDH2酶活計算
1. 按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH2活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×F=26.795×ΔA÷Cpr×F
2. 按樣本質量計算
酶活定義：每克樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH2活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T×F =10.718×ΔA÷W×F
3. 按細胞數量計算
酶活定義：每106個細胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH2活性（U/106 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =10.718×ΔA÷N×F
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，1×10-3L；V樣：反應體系中加入樣本上清體積，0.2mL；V樣總：線粒體沉淀中加入提取液體積，0.4mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；W：樣本質量，g；N：細胞總數，以106計；T：反應時間，30min；109：單位換算系數，1mol=109nmol；F：稀釋倍數。
注意事項：
1、 試劑四有毒性，實驗過程中，請佩戴好防護用具。
2、 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨測量）。
3、 樣本ΔA大于1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定。當ΔA小于0.01時，可以延長反應時間（60min或更長）來測定。計算時注意同步更改計算公式。
實驗實例
1、 取0.1067g小鼠肝臟進行樣本處理，用提取液稀釋4倍后，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測定=1.271-0.282=0.989，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.989-0=0.989，按樣本質量計算酶活得：
ALDH2活性（U/g質量）=10.718×0.989÷0.1067×4=397.380 U/g質量。
2、 取0.1069g冬棗果肉進行處理，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.267-0.162=0.105，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.105-0=0.105，按樣本質量計算酶活得：
ALDH2活性（U/g質量）=10.718×0.105÷0.1069=10.528 U/g質量。
3、 取8×106個細胞進行樣本處理，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.249-0.154=0.095，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.095-0=0.095，按細胞數量計算酶活得：
ALDH2活性（U/106 cell）=10.718×0.095÷8=0.127 U/106 cell。
參考文獻：
[1] Feng Liu, Xiangqin Cui, Harry Horner, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize. The Plant Cell. May 2001, 13:1063-1078
[2] Ying Hu, Jinbin Yin, Mingzhi Zheng, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity protects against lipopolysaccharideinduced cardiac dysfunction in rats. Molecular Medicine Reports. February 2015, 11:1509-1515
[3] Amit Joshi, Lauren Wassenhove, Kelsey Logas, et al. Aldehyde dehydrogenase 2 activity and aldehydic load contribute to neuroinflammation and Alzheimer’s disease related pathology. Acta Neuropathologica Communications. December 2019, 7:190
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