目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5075-100T/48S乙酰乙酸含量檢測試劑 微量法
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
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分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/48S |
貨號 | BC5075 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
主要用途 | 乙酰乙酸含量檢測 |
乙酰乙酸(AcAc)含量檢測試劑盒(WST法)說明書
微量法
貨號:BC5075
規格:100T/48S
產品內容:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
顯色液 | 液體1.5mL×1支 | -20℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制:
1、 試劑二:臨用前取一支加入600μL蒸餾水,充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周。避免反復凍融。
2、 試劑三:臨用前取一支加入400μL蒸餾水,充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存,可以保存2周。避免反復凍融。(試劑三由于不便保存,故多給一支)
3、 標準品:8mg 乙酰乙酸鋰。臨用前加入950μL蒸餾水,充分溶解,即8mg/mL 乙酰乙酸鋰標準溶液。-20℃分裝保存4周。
4、 工作液配制:臨用前根據試驗所需量將試劑一、試劑二、試劑三按照170:8:2(180μL,1T的量)的比例配成工作液,充分混勻,置于37℃保溫15min(此步驟不可省略),現用現配,工作液在4h內用完。
產品說明:
乙酰乙酸(AcAc)是酮體的重要成分之一,約占正常人酮體總量20%,是脂肪酸通過氧化產生的,是一種較強的有機酸。正常含量的乙酰乙酸對人體無害,糖尿病患者由于糖的利用降低,或饑餓時由于糖的代謝障礙,大量動用脂肪,乙酰乙酸的量都會積累。乙酰乙酸即可轉化成丙酮,也可以轉化成β-羥丁酸。
在檢測中,乙酰乙酸通過偶聯酶反應產生450nm吸收峰的產物,與存在的乙酰乙酸成比例。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、超聲波細胞破碎儀、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1、組織樣本的制備:按照質量(g): 提取液體積(mL)為1: 5~10的比例(建議稱取約0.1 g組織,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,12000 g離心10 min后取上清待測。
2、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);12000 g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)等其它液體樣本:直接測定。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上,調節波長至450 nm,蒸餾水調零。
2、 標準溶液配制:將80mg/mL 乙酰乙酸鋰標準溶液,用蒸餾水稀釋至0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 mg/mL標準溶液待用。
3、 按下表步驟加樣:
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 空白管 | 標準管 |
樣本 | 20 | 20 | ||
蒸餾水 | 20 | |||
標準溶液 | 20 | |||
工作液 | 180 | 180 | 180 | |
試劑一 | 180 | |||
37℃條件下反應10 min | ||||
顯色液 | 10 | 10 | 10 | 10 |
37℃條件下避光反應20 min | ||||
取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中,于450 nm處測定吸光度。分別記為A測定、A對照、A空白、A標準。ΔA測定=A空白-(A測定-A對照),ΔA標準=A空白-A標準。空白管只需做1-2次。 |
三、AcAc含量計算
1、 標準曲線繪制:以乙酰乙酸鋰標準溶液濃度為橫坐標(x,mg/mL),以ΔA標準為縱坐標(y)繪制標準曲線,得到線性回歸方程y=kx+b,將ΔA測定帶入方程求得x(mg/mL)。
2、 計算公式
(1)按照蛋白濃度計算
AcAc含量(μmol/mg prot)=x×V樣÷(V樣×Cpr)÷108.02×1000÷108.02=9.258x÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
AcAc含量(μmol/g 質量)=x×V樣÷(W×V樣÷V樣總)×1000÷108.02=9.258x÷W
(3)按照細胞或細菌數量計算
AcAc含量(μmol/104 cell)=x×V樣÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷108.02×1000=9.258x÷細胞數量
(4)按照血清(漿)體積計算
AcAc含量(μmol/mL)=x×V樣÷V樣÷108.02=9.258x
V樣:反應中加入樣本體積,20 μL=0.02 mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;細胞數量:細胞或細菌總數,以104計;V樣總:加入提取液體積,1 mL;108.02:乙酰乙酸鋰分子量,mg/mmol。
注意事項:
1、顯色完成后,請在15min之內完成檢測。
2、如果測定吸光值低于或超過線性范圍吸光值,可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。
實驗實例:
1. 取20 μL 牛血清按上述步驟進行實驗,用96孔板測定后進行計算ΔA測定=A空白-(A測定-A對照)=0.802-(0.837-0.076)=0.041,帶入標準曲線y=0.2259x+0.0145,計算x=0.117。計算
AcAc含量(μmol/mL)=9.258x=1.082μmol/mL
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