目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>> BC1540-50T/24S亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測試劑盒 常量法
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
---|---|---|---|
分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T/24S |
貨號 | BC1540 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
主要用途 | 亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測 |
亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意:本產品試劑有所變動,請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號:BC1540
規格:50T/24S
產品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體8mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 試劑二:臨用前加入6mL蒸餾水充分溶解,2-8℃保存2周;
2、 試劑三:臨用前加入15mL蒸餾水,可70-80℃加熱溶解;2-8℃保存3個月。
3、 試劑五:若出現沉淀,可70-80℃加熱溶解;
4、 標準品:10µmol/mL亞硝 *標準溶液;
5、 工作液:臨用前根據樣本量將試劑四和試劑五按1:1的比例混合,現用現配。
產品說明:
亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NiR)是亞硝態氮還原過程中的關鍵酶,在自然界氮素循環過程中發揮著重要作用,其廣泛存在于微生物及植物體內,能夠催化亞硝酸鹽還原,減少亞硝態氮在環境中的積累,降低其對生物體生長發育的毒害作用。
亞硝酸還原酶可將NO2-還原為NO,使樣本中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2-減少,即540nm處吸光值的變化可反應樣本中亞硝酸還原酶的活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、天平、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 組織:按樣本質量(g): 提取液體積(mL)1 : 5~10比例(建議稱取0.1g樣本,加入1.0mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后,于4 ℃,10000g,離心10min,棄沉淀,取上清液置于冰上待測。
2. 細菌或細胞:按細胞數量(104):提取液體積(mL)500~1000 : 1的比例(建議500萬細胞加入1.0mL提取液)加入提取液,冰浴超聲破碎細胞(功率200w,超聲3s,間隔7s,總時間3min),然后于4℃,10000g,離心10min,棄沉淀,取上清液置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min 以上,調節波長至540nm,蒸餾水調零。
2、 標準液的稀釋:將10µmol/mL的標準溶液用蒸餾水稀釋至0.08、0.06、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.0015625µmol/mL標準溶液待測。
3、 標準液稀釋可參考下表:
序號 | 稀釋前濃度(µmol/mL) | 標準液體積(µL) | 蒸餾水體積(µL) | 稀釋后濃度(µmol/mL) |
1 | 10 | 30 | 270 | 1 |
2 | 1 | 80 | 920 | 0.08 |
3 | 1 | 60 | 940 | 0.06 |
4 | 1 | 50 | 950 | 0.05 |
5 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
6 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
7 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
8 | 0.00625 | 500 | 500 | 0.003125 |
9 | 0.003125 | 500 | 500 | 0.0015625 |
備注:實驗中每個標準管需350µL標準溶液。
4、 樣本測定:
試劑名稱(μL) | 基質管 | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | - | 100 | 100 | - | - |
蒸餾水 | 100 | 200 | - | - | - |
試劑一 | 200 | - | 200 | - | - |
試劑二 | 200 | 200 | 200 | - | - |
混勻后,25℃反應1h | - | - | |||
試劑三 | 200 | 200 | 200 | - | - |
充分震蕩30s,靜置5min,取上清 | - | - | |||
上清液 | 350 | 350 | 350 | - | - |
標準品 | - | - | - | 350 | - |
蒸餾水 | - | - | - | - | 350 |
工作液 | 700 | 700 | 700 | 700 | 700 |
充分混勻,靜置5min,于1mL玻璃比色皿中測定540nm各管吸光值,分別記為A基質管、A對照管、A測定管、A標準管和A空白管,計算ΔA測定=A基質管-(A測定管-A對照管),ΔA標準=A標準管-空白管。標準曲線、空白管和基質管只需測1-2次,每個測定管需設一個對照管。 |
三、亞硝酸還原酶活性計算
1. 標準曲線的繪制
以標準溶液濃度為x軸(x,μmol/mL),標準溶液對應的ΔA標準為y軸(y,ΔA標準),建立標準曲線,得到標準方程y=kx+b,將ΔA測定帶入方程得到x(μmol/mL)。
2. 酶活計算
(1)按照蛋白濃度計算
酶活單位定義:每mg組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(U/mg prot)=x×V1÷V2÷Cpr÷T=x×7÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
酶活單位定義:每g組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(U/g 質量)=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W
(3)按照細菌/細胞數量計算
酶活單位定義:每104個細菌/細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(U/104 質量)=x×V1÷V2×V提÷細菌/細胞數量÷T=x×7÷細菌/細胞數量
V1:取上清液前的反應體系體積,0.7mL;V2:加入的樣本體積,0.1mL;V提:加入的提取液體積,1.0mL;T:反應時間,1h;W:土樣質量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;細菌/細胞數量:以104計。
實驗實例:
1、 取0.1g鳶尾葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨,按照測定步驟操作,用微量玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A基質管-(A測定管-A對照管)=0.678-(0.322-0.007)=0.363,帶入標準曲線y=8.633x+0.0038,計算x=0.0416,按樣本質量計算含量得,按樣本質量計算酶活得:
NiR(U/g 質量)=x×7÷W=0.0416×7÷0.1=2.913 U/g 質量。
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