目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC2425-100T/96S磷脂酶C(PLC)檢測試劑盒 微量法
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
---|---|---|---|
分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/96S |
貨號 | BC2425 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
主要用途 | 磷脂酶C(PLC)檢測 |
磷脂酶C(PLC)活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意:本產品試劑有所變動,請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號:BC2425
規格:100T/96S
產品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6mL×2支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體15mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液配制:
1.提取液二:試劑易揮發,用完后快速擰蓋,封口封纏口。
2.標準品:5μmol/mL對硝基苯*溶液。
3.提取液的配制:臨用前根據樣本量將提取液一與提取液二1:1混合,切勿一次性全部混合,用多少配多少。
產品說明:
磷脂酶C(EC 3.1.4.3)是一種水解甘油磷酸酯C3位點甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶,廣泛存在于微生物及動植物的組織和細胞中,在細胞代謝、細胞傳遞、生長發育等方面具有重要作用。
磷脂酶C催化水解NPPC產生對硝基苯*,在410nm處有特征吸收峰。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、超速冷凍離心機、可調式移液槍、天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水、冰。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1、 組織:按照質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例加入提取液,建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液,冰浴勻漿后于4℃,10 000g離心5min;取全部上清再于4℃、100 000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。
2、 細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后于4℃,10 000g離心5min;取全部上清再于4℃、100 000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。
3、 血清(漿):直接測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min 以上,調節波長到410nm,分光光度計蒸餾水調零。
2、 標準溶液的稀釋:將5μmol/mL對硝基苯*溶液用蒸餾水稀釋至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.02、0.01μmol/mL。
3、 標準品稀釋表:
序號 | 稀釋前濃度(μmol/mL) | 標準液體積(µL) | 蒸餾水體積(µL) | 稀釋后濃度(μmol/mL) |
1 | 5 | 125 | 375 | 1.25 |
2 | 1.25 | 200 | 200 | 0.625 |
3 | 0.625 | 200 | 200 | 0.3125 |
4 | 0.3125 | 200 | 200 | 0.15625 |
5 | 0.15625 | 200 | 200 | 0.078 |
6 | 0.078 | 200 | 200 | 0.039 |
7 | 0.039 | 200 | 200 | 0.02 |
8 | 0.02 | 200 | 200 | 0.01 |
備注:實驗中每個標準管需20µL標準溶液。
4、 樣本測定:(在EP管或者96孔板中加入下列試劑)
試劑名稱 (μL) | 空白管 | 測定管 | 標準管 |
標準品 | - | - | 20 |
樣本 | - | 20 | - |
試劑一 | 20 | - | - |
試劑二 | 100 | 100 | 100 |
充分混勻,37℃反應30min | - | ||
試劑三 | 80 | 80 | 80 |
充分混勻后測定410nm處吸光值,分別記為A空白、A測定和A標準,ΔA=A測定管-A空白管,ΔA標=A標準-A空白。標準曲線和空白管只需做1-2次。 |
三、酶活計算
1、 標準曲線:
以標準品濃度(x,μmol/mL)為橫坐標,吸光度ΔA標(y)為縱坐標建立標準曲線。根據標準曲線,將ΔA帶入公式中計算濃度x(μmol/mL)。
2、 酶活測定:
(1)按蛋白濃度計算
酶活定義:每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性 (U/mg prot) = x×V樣÷(V樣×Cpr) ÷T = 0.033× x÷ Cpr
(2)按樣本質量計算
酶活定義:每克組織每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性 (U/g 質量) = x×V樣總÷W÷T = 0.033× x÷W
(3)按細菌或細胞數量計算
酶活定義:每104個細胞每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性(U/104 cell)= x×V樣總÷細胞數量÷T= 0.033× x÷細胞數量
(4)按血清(漿)體積計算:
酶活定義:每毫升血清每分鐘水解NPPC產生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個酶活力單位。
PLC活性(U/mL)= x÷T = 0.033× x
V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入的試劑一體積,1mL;W:樣本質量,g;細胞數量:以萬計;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;T:反應時間,30min。
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