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目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測(cè)試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5205-100T/48S輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法

輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法
  • 輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法
參考價(jià) 面議
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)
參考價(jià) 面議
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)
  • 品牌 SOLARBIO/索萊寶
  • 型號(hào) BC5205-100T/48S
  • 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)商
  • 產(chǎn)品資料 查看pdf文檔
  • 所在地 北京市
屬性

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更新時(shí)間:2024-07-09 11:07:24瀏覽次數(shù):657評(píng)價(jià)

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CAS 詳詢 純度 詳詢
分子量 詳詢 分子式 詳詢
供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 100T/48S
貨號(hào) BC5205 應(yīng)用領(lǐng)域 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合
主要用途 輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測(cè)
輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法
有效期
6個(gè)月
儲(chǔ)存條件
-20℃
單位

英文名稱
CoenzymeⅡ NADP(H) Content Assay Kit (WST colorimetry)
檢測(cè)方法
微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
規(guī)格
100T/48S

輔酶 II NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)WST顯色法)

微量法

貨號(hào)BC5205

規(guī)格100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

試劑名稱

規(guī)格

保存條件

酸性提取液

液體25 mL×1

2-8℃保存

堿性提取液

液體25 mL×1

2-8℃保存

試劑一

液體10 mL×1

2-8℃保存

試劑二

粉劑×1

-20℃保存

試劑三

液體4mL×1

2-8℃保存

試劑四A

粉劑×1

-20℃保存

試劑四B

液體10mL×1

2-8℃保存

試劑五

液體25 mL×1

2-8℃保存

NADP標(biāo)準(zhǔn)品

粉劑×1

-20℃保存

NADPH標(biāo)準(zhǔn)品

粉劑×1

-20℃保存

溶液的配制:

1、 試劑二:臨用前加入4mL蒸餾水充分混勻,溶解后2-8℃保存4周。

2、 試劑四:臨用前將試劑四A溶解到試劑四B中,分裝保存,避免反復(fù)凍融,-20℃保存4周。

3、 NADP標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.27 mL 蒸餾水,即 5 µmol/mL-20℃可以保存2周。

4、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品:臨用前加入 1.2 mL 蒸餾水,即 5 µmol/mL-20℃可以保存2周。

產(chǎn)品說(shuō)明:

輔酶Ⅱ NADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NADP+ NADPH 含量測(cè)定可以計(jì)算 NADPNADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值,其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一,而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+NADPH1-mPMS作用下,WST-1可與NADPH 反應(yīng),產(chǎn)生水溶性formazan,在450nm下有特征吸收峰,而NADP+可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH,進(jìn)一步采用WST-1檢測(cè)。

 

注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋研缽/勻漿器、超聲破碎儀,可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟:

 

一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

1、血清(漿)中NADP+NADPH的提取:

NADP+的提取:取血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為1:5-10的比例,(建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5 mL酸性提取液),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

NADPH的提取:取血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為1:5-10的比例,(建議取0.1mL血清(血漿),加入0.5 mL堿性提取液),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

2、組織中NADP+NADPH的提取:

NADP+的提取:建議取0.1g組織質(zhì)量,加入0.5mL酸性提取液,冰浴研磨,煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

NADPH的提取:建議取0.1 g組織質(zhì)量,加入0.5 mL堿性提取液,冰浴研磨煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中NADP+NADPH的提取:

NADP+的提取先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),離心棄上清,建議500萬(wàn)細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL酸性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失)冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL堿性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)。

NADPH的提取建議500萬(wàn)細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL堿性提取液,超聲波破碎(冰浴,功率200W,超聲3s,停10s,重復(fù)30),煮沸 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴冷卻后,10000g4℃離心10min;取200μL上清液,加入200μL酸性提取液使之中和;混勻,10000g 4℃離心 10min,取上清,冰上待測(cè)

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 NADP+標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為52.51.250.6250.31250.156250nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0nmol/mL即空白管)

3、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品:用蒸餾水稀釋為1052.51.250.6250.31250.156250nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0nmol/mL即空白管)

4、 稀釋表(附于說(shuō)明書(shū)最后)

5、 EP管中按順序加入下列試劑

試劑名稱(µL

對(duì)照管(A1A1

測(cè)定管(A2A2

標(biāo)準(zhǔn)管

樣品/標(biāo)準(zhǔn)品

20

20

20

試劑

200

-

-

試劑一

80

80

80

試劑二

30

30

30


試劑三

30

30

30

 


試劑四

30

30

30

充分混勻,室溫避光靜置1h

試劑


200

200

   混勻,取200μL至微量玻璃皿或96孔板中,讀取吸光值NADP+的記為:ΔA NADP+A2- A1NADPH的記為ΔANADPHA2A1’,NADP標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NADP標(biāo)A標(biāo)-A空白管NADPH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA NADPH標(biāo)A標(biāo)-A空白管。(標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2,每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管)

三、NADP+NADPH含量計(jì)算

1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:

1NADP+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x1nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y1ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA測(cè)定代入方程得到x1nmol/mL

2NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x2nmol/mL)和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y2ΔA標(biāo)準(zhǔn)),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,ΔA′代入方程得到x2nmol/mL

2NADP+NADPH含量計(jì)算

(一)NADP+含量計(jì)算

(1) 按液體體積計(jì)算:NADP+含量(nmol/mL= x1×V提取+V血清)÷V血清=11×x1

(2) 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NADP+ (nmol/mg prot= x1×V提取÷(V提取×Cpr)= x1 ÷ Cpr

(3) 按樣本鮮重計(jì)算NADP+含量(nmol/g質(zhì)量= x1×V提取÷W= x1÷W 

(4) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:NADP+含量(nmol/104 cell= x1×V提取÷500=0.002×x1

(二)NADPH含量計(jì)算

(1) 按液體體積計(jì)算:NADPH含量(nmol/mL= x2×V提取+V血清)÷V血清=11×x2

(2) 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NADPH (nmol/mg prot= x2×V提取÷(V提取×Cpr)= x2 ÷ Cpr

(3) 按樣本鮮重計(jì)算NADPH含量(nmol/g 質(zhì)量= x2×V提取÷W= x2÷W 

(4) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:NADPH含量(nmol/104 cell= x2×V提取÷500=0.002×x2

V提取:加入提取液體積,1mLV血清血清(漿)體積0.1mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣

本質(zhì)量,g500細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)500萬(wàn)

注意事項(xiàng):

1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三按比例配成混合液

2、反應(yīng)過(guò)程中注意避光。

3、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管,本試劑盒100管可以測(cè)定48個(gè)NADP+NADPH

4、如果測(cè)定吸光值超過(guò)線性范圍吸光值,可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例:

1. 1NADP+測(cè)定:稱取 0.1g冬青葉片按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.075-0.069=0.006,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.098NADP+含量得:

NADP+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=0.98 nmol/g 質(zhì)量。

 

NADPH測(cè)定稱取 0.1g 冬青葉片按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.155-0.110=0.045,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=1.335NADPH含量得:  NADPH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=13.35 nmol/g 質(zhì)量。

2. NADP+測(cè)定:稱取 0.1g 小鼠肝臟按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.194-0.146=0.048,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.3NADP+含量得:

NADP+ (nmol/g 質(zhì)量)= x1÷W=2.999nmol/g 質(zhì)量。

NADPH測(cè)定稱取 0.1g 小鼠肝臟按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.170-0.141=0.029,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=1NADPH含量得:

NADPH (nmol/g 質(zhì)量)= x2÷W=10 nmol/g 質(zhì)量。

3. NADP+測(cè)定0.1mL牛血清按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.077-0.067=0.010,標(biāo)準(zhǔn)曲線y1=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x1=0.117NADP+含量得:

NADP+ (nmol/mL= 11×x1=1.29 nmol/mL

NADPH測(cè)定0.1mL牛血清按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作,96孔板測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.084-0.072=0.012,標(biāo)準(zhǔn)曲線y2=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x2=0.644NADPH含量得:

NADPH (nmol/mL= 11×x2=7.088 nmol/mL

相關(guān)系列產(chǎn)品:

BC1100/BC1105  輔酶II NADPH)含量檢測(cè)試劑盒(MTT顯色法)

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輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法 輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒 微量法

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