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乙酰乳酸合成酶（ALS）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5525

規格：50T/24S、100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

50T溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前將試劑一A，試劑一B溶于試劑一C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。

2、 試劑三：臨用前將試劑三A，試劑三B溶于試劑三C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。

3、 試劑六：臨用前加入1mL無水乙醇溶解。-20℃可保存4周。

4、 試劑六工作液：臨用前根據樣本量按試劑六：試劑六稀釋液=0.1mL：0.7mL（共0.8mL，8T）的比例配制，現用現配。當天用完。

5、 標準品：100μmol/mL 乙偶姻標準液（即10⁵ nmol/mL 乙偶姻標準液）。

6、 100nmol/mL標準溶液的配制：取10⁵ nmol/mL 乙偶姻標準液50μL和950μL蒸餾水混合，即5000nmol/mL標準溶液；再取20μL 5000nmol/mL標準溶液和980μL蒸餾水混合，即100nmol/mL標準溶液。

100T溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前將試劑一A，試劑一B加入試劑一C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。

2、 試劑三：臨用前將試劑三A，試劑三B溶于試劑三C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。

3、 試劑六：臨用前加入2mL無水乙醇溶解。-20℃可保存4周。

4、 試劑六工作液：臨用前根據樣本量按試劑六：試劑六稀釋液=0.1mL：0.7mL（共0.8mL，8T）的比例配制，現用現配。當天用完。

5、 標準品：100μmol/mL 乙偶姻標準液（即10⁵ nmol/mL 乙偶姻標準液）。

6、 100nmol/mL標準溶液的配制：取10⁵ nmol/mL 乙偶姻標準液50μL和950μL蒸餾水混合，即5000nmol/mL標準溶液；再取20μL 5000nmol/mL標準溶液和980μL蒸餾水混合，即100nmol/mL標準溶液。

產品說明：

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，ALS，EC 4.1.3.18)，又稱乙酰羥基酸合成酶(Acetohydroxyacid synthase，AHAS)。ALS存在于植物生長的過程中，是誘導支鏈氨基酸(Ile、Leu、Val)生物合成過程中第一階段的關鍵酶。

ALS催化丙酮酸生成乙酰乳酸，乙酰乳酸在一定條件下脫羧生成乙偶姻，乙偶姻在堿性環境下與肌酸和α-萘酚反應生成紅色物質，在525nm下有最大吸光值。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、分析天平、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、蒸餾水、病、無水乙醇和硫酸銨。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：2~4的比例（建議稱取約0.5g到1g組織，加入試劑一定容至2mL），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心20min。取1mL上清，轉移至新的2mL EP管中。

2. 在取出的上清中加入約0.5g硫酸銨，充分溶解后4℃靜置2h。然后15000g 4℃離心20min，棄掉上清。沉淀中加入0.5mL試劑二，充分溶解冰上待用（若按蛋白濃度計算，則用此粗酶液自行測定蛋白濃度）。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至525nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。

4、在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：

三、乙酰乳酸合成酶活性計算

按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：37℃每mg組織蛋白每小時催化產生1nmol乙酰乳酸定義為一個酶活力單位。

ALS活性（U/mg prot）= C_標準×?A_測定÷?A_標準×V_酶促÷（Cpr×V_樣）÷T×F= 2.1×x÷Cpr×F

按樣本質量計算

單位的定義：37℃每g組織每小時催化產生1nmol乙酰乳酸定義為一個酶活力單位。

ALS活性（U/g 質量）= C_標準×?A_測定÷?A_標準×V_酶促÷（W÷2÷V_提取×V_樣）÷T×F= x×2.1÷W×F

V_酶促：37℃反應體系體積，0.42mL；V_提取：加入的試劑三體積，0.5mL；V_樣：加入的樣本體積，0.2mL；T：37℃反應時間，1h；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2：2mL 樣本勻漿取1mL；F：樣本稀釋倍數。

注意事項：

1、 如果?A_測定大于1，可以對樣品進行稀釋或者縮短37℃反應時間；測定吸光值或?A_測定小于0.01，可以加大樣本量或者延長37℃反應時間。最終計算時同步修改計算公式。

實驗實例：

稱取0.5037g胡蘿卜組織，按照前處理步驟操作進行提取酶液，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?_測定=A_測定-A_對照=0.308-0.198=0.11，?A_標準=A_標準-A_標準空白=0.671-0.173=0.498，帶入公式計算：

ALS活性（U/g 質量）= 210×?A_測定÷?A_標準÷W×F=92.090 U/g 質量

參考文獻：

[1] George, MouradJohn, King. Effect of four classes of herbicides on growth and acetolactate-synthase activity in several variants of Arabidopsis thaliana[J]. Planta, 1992, 188(4):491-497.

[2] Hwang I T , Ko Y K ,  Kim T J , et al. Structure–Activity Relationships of Acetolactate Synthase Inhibition among New Benzenesulfonylureas in Rice (Oryza sativa) and Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli var. oryzicola)[J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2000, 68(3):166-172.

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