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當前位置:南京賽泓瑞生物科技有限公司>>分子生化產品>> KGA7024,7034,7044TUNEL原位檢測試劑盒(細胞 )

TUNEL原位檢測試劑盒(細胞 )

參  考  價:面議
具體成交價以合同協議為準

產品型號KGA7024,7034,7044

品牌

廠商性質生產商

所在地南京市

更新時間:2017-07-24 13:28:56瀏覽次數:840次

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南京賽泓瑞生物公司*為實驗室供應常規生化試劑類產品,分子生物學試劑及細胞培養類產品。產品性能高,質量好,試驗中穩定性好。。

TUNEL原位檢測試劑盒(細胞)(FITC標記POD法)(TdT酶介導的原位末端標記dUTP檢測試劑盒)(DNA片段化檢測試劑盒)

Cat numberKGA      
Store at-20 for one year
Expire date
For Research Use Only
凱基TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒
FITC標記POD,細胞樣本)
使用說明書
CatKGA7024,7034,7044 
20,50,100Tests
 
一、 TUNEL檢測原理   
二、試劑盒組分        
三、檢測樣本的預處理
   1細胞樣本的準備   
2陽性對照及陰性對照的準備
四、 標記及顯色反應      
五、 常見問題的原因及*解決方案 
一、TUNEL試劑盒說明
凱基TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC標記POD法)是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況,其原理是熒光素(fluorescein)標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3-OH末端,可用熒光顯微鏡檢測;熒光素亦可被抗熒光素抗體(anti-fluorescein antibody)標記,,在辣根過氧化酶底物二氨基聯苯胺(DAB)的存在下,產生很強的顏色反應(呈棕色),特異準確地定位正在凋亡的細胞,因而在普通光學顯微鏡下即可觀察和計數凋亡細胞。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被標記或染色。本試劑盒于細胞樣本(細胞涂片)的凋亡原位檢測。
本試劑盒特點
操作簡便:使用Ready-to-Use型試劑,配有DAB。
高靈敏度:可以單一檢出初期的凋亡細胞。
高特異性:能特異性染色凋亡細胞。
快速操作:整體操作約需3小時。
方便觀察:可使用熒光顯微鏡觀察實驗結果,亦可在信號轉換后使用光學顯微鏡觀察實驗結果。
高正確性:有陽性對照片的制備方法,可以確認試劑盒的有效性
二、TUNEL試劑盒組分
  
Cat: KGA-7024
20 assays
Cat: KGA-7034
50 assays
Cat: KGA-7044
100 assays
儲存條件
Equilibration Buffer
1.0 mL
2.5 mL
5.0 mL
-20
FITC-12-dUTP
20μL
50μL
100μL
-20
TdT Enzyme
80μL
200μL
400μL
-20
anti-fluorescein antibody
200μL
500μL
1000μL
-20
DAB
2mg
5mg
10 mg
-20
 
 
 
 
注意事項
 
1使用前請認真閱讀本說明書,提前準備好相關試劑。
2因本試劑盒中組分均為微量,使用前請離心集液。
3為避免試驗誤差、降低試劑的損耗,建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。
4TdT 酶反應液在使用前根椐樣本數量集中配制,再分別滴加于各樣本片上,避免每個樣本單獨配制而產生的試劑損耗。
5另因DAB為固體粉末,使用前加入適量PBS溶解,配制成20×DAB(10 mg/ml)后,按下述方法顯色使用。
6. 用戶自備:多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染蘇木素染液蓋玻片、載玻片、染色缸。
三、檢測樣本的預處理
TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在,本說明書*的條件僅為普遍情況,用戶需根椐自已的樣本材料及*試驗結果來調整各個條件(參照Page 8),如處理時間、處理濃度等,來優化出適合自身樣本的試驗條件,從而做出客觀的試驗結果。
1細胞樣本的準備.
          
操作注意事項:
1為防止樣本脫落,請使用硅烷(Silane)處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。
2固定好的樣本可以在-2070%乙醇中放置30分鐘或至過夜,以改善細胞的滲透性。
3使用PBS清洗細胞樣本時,不要直接加在細胞樣本上,以防止細胞樣本的脫落。
4進行PBS清洗時,以5分鐘清洗3次為標準
5. 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備,請按上述方法配制。
2.陽性對照及陰性對照的準備
TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照,以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩個樣本來制備陽性及陰性片,其后續步驟與待測樣本同樣進行。
 
 A陽性對照樣本的準備
  細胞樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后,再加入100μL DNase I反應液(10U~3000U DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2)(用戶自備)室溫~37處理10~30 min,其余步驟均相同。如有問題詳見Page 8.
B陰性對照樣本的準備
Page 6標記反應制備TdT酶反應液時,不添加TdT酶,其余步驟均相同。
四、標記和顯色反應
操作注意事項:
1. 進行PBS清洗時,以5分鐘清洗3次為標準。
2. PBS清洗后,為了各種反應的有效進行,請盡量除去PBS溶液后再進行下一步反應。
3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后,請蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進行,這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。
4. TdT酶反應液即用即配,短暫于冰上保存。不宜*保存,*保存會導酶活性的失活。
5.如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制。
6.蘇木素復染:將切片放入蘇木素染液,染色­­­­­ 30min ,蒸餾水沖洗干凈放入鹽酸甲醇溶液中5s,立即用蒸餾水沖洗干凈。分別用70%、85%、95%、無水乙醇浸泡­­­­­5分鐘。用二甲苯浸泡­­­­­10分鐘,更換二甲苯后再浸泡­­­­­10分鐘。晾干后在切片上加中性樹膠,加蓋玻片。
現象
可能原因
建議
非特異性染色
TdT酶的濃度過高
TdT dilution buffer* 12110稀釋
內源過氧化物酶未被封閉
封閉液室溫(15-25)封閉10min(封閉液: 3%H2O2溶于甲醇)
Anti-fluorescein-POD 非特異性結合
l       anti-mouse serum封閉
l       3%BSA溶于PBS封閉20min
l       稀釋HRP工作液濃度至50%
固定后某些核酸酶活性依然較高
用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉
染色背景較高
福爾馬林固定導致某些含黑色素前體的細胞染成黃色
嘗試以甲醇固定,但可能會降低檢測的敏感性。
內源過氧化物酶未被封閉
封閉液室溫(15-25)封閉10min(封閉液: 3%H2O2溶于甲醇)
Anti-fluorescein-POD 非特異性結合
l       anti-mouse serum封閉
l       3%BSA溶于PBS封閉20min
l       稀釋工作液濃度至50%
樣本被支原體污染
使用支原體檢測試劑盒檢測,如陽性則制備未被污染的新樣本
標記反應試劑的濃度過高
稀釋50%,以降低標記反應的濃度*TdT dilution buffer60 mM KPB 緩沖液(pH7.2),150 mM KCl, 1 mM 2-ME, 50 % Glycerol
細胞處于高度增殖期
使用Annexin –V-Flous雙重著色
DAB孵育時間過長
減少DAB染色時間
標記率低、染色淡至無
如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低(因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯,而在操作中丟失)
用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
或福爾馬林或戊二醛固定。
過度的固定導致與蛋白過度交聯
縮短固定時間,或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
促滲條件不佳,以致于試劑不能到達靶分子或濃度過低
l       增加通透劑促滲時間
l       增加通透劑的作用溫度(15~25℃)
復染信號較弱
選擇的染料不合適
用溶于0.1M醋酸*的5%甲基綠PH4.0,或蘇木素復染
陽性對照沒有信號
DNase I的濃度過低
l         一般樣本使用1-10U/ml DNase I
l         反應緩沖液:10mM Tris-HCl PH 7.4 10 mM NaCl, 5mM MnCl2, 0.1mM CaCl25mM KCl2 37 反應30 min,PBS洗去。
 常見問題的原因及*解決方案.
凱基相關產

人前列腺癌細胞,TCHu100

人前列腺癌細胞,TCHu100

TRAP-PCR銀染法端粒酶活性檢測

細菌蛋白提取試劑盒$r$n$r$n$r$n南京賽泓瑞生物公司*為實驗室

紅細胞裂解液

紅細胞裂解液

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