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雙熒光素酶報告基因實驗結果不理想？看這里！
熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產生生物熒光的酶的總稱，其中有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。由于兩種酶底物和發光顏色的區別，且在動物體內無內源性表達，使其在雙報告實驗中得到廣泛應用。
1.檢測原理
螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時產生黃綠色光，波長540-600nm，一般檢測時選用560nm。
海腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產生藍光，波長460-540nm，一般檢測時選用460nm。
不同于綠色熒光蛋白（GFP）需要一定的光激發才能發光，且易淬滅；熒光素酶經過反應本身就可以自發熒光，并且只有在底物存在時才能發光。因此GFP只能用于標記或檢測反應是否發生，而熒光素酶報告實驗卻能通過熒光值定量分析熒光素酶的表達水平。
2.應用方向
熒光素酶作為一種理想的報告基因，可用于啟動子研究、miRNA研究、信號轉導通路研究等等。
在報告基因的5'端加上待檢測基因的啟動子，就可以用來檢測轉錄因子對啟動子的作用，啟動轉錄越多，那報告基因的表達量就越大，熒光值越高。如果在報告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用來檢測miRNA對于目的基因的調控（抑制作用），報告基因表達越少，說明miRNA的作用就越強。
一般情況下，海腎熒光素酶基因作為內對照使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質粒與報告基因質粒共轉染細胞；或是將兩個報告基因構建到同一個質粒上，分別用不同的啟動子啟動其表達。計算結果時，將螢火蟲熒光素酶的檢測值比上海腎熒光素酶檢測值，這樣就可以減少內在變化因素對實驗準確性的影響，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。
3.常見問題分析
正是由于報告基因檢測結果受多種因素影響，如載體狀態、細胞狀態、轉染量、轉染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等，一旦某個細節處理不好，都可能導致實驗失敗或結果的不準確。小翊為此精心整理了大家實驗過程中遇到的幾類常見的問題和解決辦法。
1）熒光值過高
熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：
A.減少質粒轉染量；
B.細胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或對裂解產物進行稀釋后檢測。
注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達水平，否則會造成檢測結果出現大的偏差。
2）熒光值過低或無熒光值
熒光素酶的表達水平與啟動子活性相關，正常表達水平下檢測到的熒光值應在105數量級左右，若檢測到的熒光值比較低或無熒光值，可從啟動子活性、轉染效率、檢測過程這幾方面進行考慮：
轉染效率低
A.優化轉染實驗條件，用較易轉染的質粒做陽性對照（如轉染過表達熒光蛋白質粒）；
B.確保轉染DNA的質量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質量進行鑒定；
C.選擇活性較高，處于指數分裂期的細胞進行轉染。
啟動子活性低或誘導失敗
A.轉染后的細胞培養使用特異性誘導啟動子的條件；
B.優化細胞的培養條件，提高熒光素酶的表達量；
C.更換強啟動子（如SV40、CMV）。
注：海腎熒光素酶基因作為內對照，其表達應不受時期、部位、環境影響，因此常用組成型表達的TK啟動子。
樣品裂解效率低
A.細胞培養時間不宜過長，12-36h內醉好，長時間培養后，細胞可能會難裂解；
B.加入的裂解液需足量，保證細胞能夠充分裂解。
檢測過程操作不規范
A.選擇合適的檢測儀器，能夠檢測化學發光或者生物發光的儀器都適用于該實驗；
B.需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會造成檢測結果出現很大偏差；
C.室溫反應。反應時各個組分（細胞裂解產物，底物工作液等）都需要調整到室溫；
D.熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內完成。
底物氧化失效
A.底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；
B.反應工作液建議現用現配。
3）復孔重復性差
報告基因檢測實驗受多種因素影響，因此同批次樣品檢測值也可能出現浮動。除了引入另一個報告基因作為內參照避免實驗條件變化的干擾之外，一般還需設置3個或3個以上復孔。想要得到一個準確的結果，應盡可能減小復孔之間的差異性：
A.細胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；
B.保證加樣的準確性，移液器需定期校準，確保移液；
注：熒光素酶報告基因實驗的檢測結果非常靈敏，復孔之間的數值有一定差異是正常的，一般認為在同一個數量級的差異是可以接受的。
以上就是大家平常給小翊反饋多的幾個問題，讀完此文大家是否對這個實驗有了更深一步的認識？如果您在實驗中還遇到其他問題，歡迎留言或電話咨詢。下面是福利時間！
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