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產品信息

產品描述

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的過程中會發出波長為560 nm左右的生物螢光。海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的過程中會發出波長為480nm左右的生物螢光。兩種生物螢光都可通過化學發光儀進行測定。檢測原理如圖所示：

圖1：螢火蟲和海腎螢光素酶檢測原理圖

Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit是一種輝光型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒，具有高靈敏度和發光信號穩定的特點。本試劑盒中含有高純度的螢火蟲螢光素和腔腸素，在同一個樣品中先以螢火蟲螢光素為底物檢測螢火蟲螢光素酶，后淬滅螢火蟲螢光素酶的螢光信號，并同時以腔腸素為底物檢測海腎螢光素酶，實現雙螢光素酶報告基因檢測。海腎螢光素酶作為內參，消除了因孔間細胞數量、轉染效率不同等造成的影響，使得檢測結果的準確性更高。

相對于閃光型Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（Cat 11402），本品具有以下優點：1）發光信號更穩定性，為實驗設計提供了更大的靈活性。2）更符合高通量檢測，無需依賴自動進樣器，并且無需棄培養液、離心等步驟，大大的簡化了實驗流程。3）無明顯刺激性氣味。本試劑盒可用于多種常用細胞培養液：RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等，其半衰期均為2h左右（22℃），滿足絕大多數高通量實驗需求。

產品組分

運輸與保存方式

干冰運輸。未拆封試劑盒-20℃保存，有效期1年。

溶解分裝后的D-輝光型螢火蟲和海腎螢光素酶底物于-70℃避光保存1年，或-20℃短期保存不超過1個月。

使用說明

1.需自備的材料

單/多道移液器；不透光細胞培養白板；化學發光儀或帶化學發光檢測模塊的酶標儀。

2.檢測試劑準備

1）螢火蟲螢光素酶檢測試劑：使用時將D-輝光型螢火蟲螢光素酶緩沖液一次性全部倒入D-輝光型螢火蟲螢光素酶底物瓶中，充分混勻直至底物*溶解。按使用需求分裝，建議-70℃長期保存或-20℃保存不超過一個月。

2）海腎螢光素酶檢測試劑：根據實際使用量，以100:1的比例將適量的D-輝光型海腎螢光素酶緩沖液與D-輝光型海腎螢光素酶底物(100×) 混勻，室溫避光備用（例如：如果需要100 mL緩沖液，則需要加入1 mL的底物），建議現配現用。

注：1）兩種緩沖液都可以4℃，室溫或水浴融化，但溫度不能超過25℃。

2）D-輝光型海腎螢光素酶底物(100×)，每次開蓋前需進行短暫低速離心。

3.操作步驟

1）從細胞培養箱中取出含哺乳動物細胞的培養板，放置5-15 min，平衡至室溫。

2）螢火蟲螢光素酶活性檢測：

①加入與待測細胞培養液等體積并平衡至室溫的螢火蟲螢光素酶檢測試劑（例如，96孔板建議加入80 μl培養液，相應加入80 μl檢測試劑；384孔板通常加入20 μl培養液，相應加入20 μl檢測試劑）。

②在水平搖床上室溫混勻至少10 min。（注：不要用移液器吹吸混勻，產生的氣泡會影響發光檢測讀數。）

③在化學發光檢測儀或帶化學發光模塊的多功能酶標儀上檢測螢火蟲螢光素酶發光信號，加入檢測試劑后2 h內完成檢測。

3）海腎螢光素酶活性檢測：

①加入平衡至室溫的海腎螢光素酶檢測試劑，加樣體積與初始細胞培養液體積相同并充分混勻。（例如，96孔板建議加入80 μl培養液，相應加入80 μl檢測試劑；384孔板通常加入20 μl培養液，相應加入20 μl檢測試劑）。

②在水平搖床上室溫混勻至少10 min。

③在化學發光檢測儀或帶化學發光模塊的多功能酶標儀上檢測海腎螢光素酶發光信號，加入檢測試劑后2 h內完成檢測。海腎螢光素酶在微孔板上的檢測順序應與螢火蟲螢光素酶的檢測順序相同。

4）數據分析：

①實驗設計：根據不同實驗目的，在每個培養板中都應設置空白對照組，實驗組和對照組。

a.空白對照組

背景F：未轉染細胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

背景R：未轉染細胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑+海腎螢光素酶檢測試劑。

注：用于空白對照組樣品量必須與實驗樣品量相同，并且包含與實驗樣品相同的培養基/血清組合。

b.實驗組：轉染細胞經實驗化合物處理(即實驗組F和實驗組R)。

c.對照組：轉染細胞不經處理，用以標準化結果(即對照組F和對照組R)。

②計算結果：實驗組比值=(實驗組F-背景F）/(實驗組R-背景R)，對照組比值=(對照組F-背景F）/(對照組R-背景R)。

表達倍數=實驗組比值/對照組比值。

注意事項

1）反應溫度：酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將檢測試劑以及細胞培養液平衡至室溫（20-25℃）。

2）檢測儀器：能檢測化學發光的儀器都適用，但由于不同儀器的設置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同。

3）檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光細胞培養白板。

4）檢測設置：Luminescence，350-700 nm，建議讀板時間設為0.5-1 sec。

5）發光信號會受到檢測環境如培養基組分、溫度等影響，應確保同組內不同樣本檢測條件一致。

6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套。

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