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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50ML |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 12303ES50 | 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 |
文庫稀釋液 Library Dilution Buffer | 12303ES50 | 50 mL |
產品描述
文庫稀釋液 Library Dilution Buffer (10 mM Tris-HCl ，pH 8.0 [25℃]，0.05% Tween 20)，用于不同種類建庫試劑盒最終文庫的稀釋，請勿使用水或 TE 作為稀釋液。稀釋后的文庫和解凍后的DNA Standards（12307ES09）置于冰上存放，文庫應現用現稀釋，用完丟棄。本產品可搭配qPCR Master Mix（Cat#12302: 包含定量所需的 qPCR Master Mix、定量擴增引物和參比染料 ROX。擴增引物根據 NGS 文庫接頭序列 P5 和P7 設計，可保證特異性擴增雙端接頭完整的文庫；qPCR Master Mix 是基于抗體法熱啟動的染料法 qPCR 預混液。）使用，可對不同長度、不同 GC 或 AT 含量樣本高效、特異擴增，實現精確定量。
產品組分
編號 | 名稱 | 規格 | 價格/元 |
12303 | Library Dilution Buffer | 50 mL | 485 |
運輸與保存方法
冰袋運輸。所有組分 -20℃ 保存，有效期 12 個月。
注意事項
一、關于操作
1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2.請于使用前確保產品凍融和*混勻，短暫離心收集至管底后置于冰上備用。
3.為保證產品品質，避免反復凍融超過 30 次！
4.為避免樣品交叉和氣溶膠污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。
5.試劑吸取時應保證槍頭適當深入液體，排出時應確認槍頭無殘留。
6.為避免交叉污染，建議在不同區域分別進行模板制備、體系配制和加模板操作。
二、關于文庫稀釋
由于 DNA 在非緩沖環境中易降解，因此應使用緩沖稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20，對應貨號12303ES50）稀釋文庫，切勿使用水或TE作為稀釋液。測定時，文庫應現測現稀釋，置于冰上待測，切勿使用以往配制儲存的稀釋文庫。
文庫需稀釋至標準曲線有效 Ct 范圍內進行定量，稀釋比例可參照過往經驗或使用其他測定方式測定的濃度作為參考（如NanoDrop®，Qubit®或 Bioanalyzer）。使用本試劑盒可定量的文庫濃度范圍參見下表。
DNA Standard | 摩爾濃度 | 質量濃度 | 拷貝數濃度 |
Std 1 | 20 pM | 5.5 pg/μL | 12×10 6 copies/μL |
Std 2 | 2 pM | 0.55 pg/μL | 12×10 5 copies/μL |
Std 3 | 0.2 pM | 0.055 pg/μL | 12×10 4 copies/μL |
Std 4 | 0.02 pM | 0.0055 pg/μL | 12×10 3 copies/μL |
Std 5 | 0.002 pM | 0.00055 pg/μL | 12×10 2 copies/μL |
Std 6 | 0.0002 pM | 0.000055 pg/μL | 12×10 1 copies/μL |
三、污染與陰性對照（Contamination and No-template Controls）
1.進行qPCR 實驗時，應保證良好的實驗操作規范，以防對工作區域、試劑、耗材、儀器、DNA 標準品等造成污染。推薦將反應體系配制區和模板制備區進行物理隔離，并定時使用 0.5% 次氯酸鈉或 10% 漂白劑對各實驗區域進行擦拭清理。
2.反應體系配制過程中DNA Standards 的加入應按照從低濃度至高濃度（DNA Standard 6 至 1）的順序進行，每次移液都應更換新的槍頭，以避免氣溶膠污染。
3.每次實驗都應平行進行NTC陰性對照反應，配合融解曲線進行擴增特異性和體系污染程度分析。因擴增引物序列為Illumina®平臺固定序列而非 qPCR 專用引物序列，且擴增循環數較多，NTC 陰性對照反應出現引物二聚體擴增進而產生 Ct 屬正常情況。正常情況下 Ct（NTC）> Ct （DNA Standard 6）+ 3。
使用方法
一、解凍試劑
將文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20，對應貨號12303ES50），從冰箱中拿出，置于室溫 30 min 以上。確保各試劑*解凍并*混勻，短暫離心后置于冰上備用。
二、稀釋文庫
使用文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20，對應貨號12303ES50）對待測文庫進行適當稀釋。推薦稀釋度為1:10000-1:100000。對于高濃度文庫，可額外設置 3 個 2 倍稀釋梯度，如按 1:10000 稀釋文庫，可額外設置 1:20000，1:40000，1:80000 稀釋比例，以保證測定值在試劑盒所提供的標曲范圍內。
三、反應體系配制
于反應管中配制體系（如下表），上下顛倒或渦旋振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
名稱 | 體積 |
Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix（2×） | 10 μL |
qPCR Primer Mix | 2 μL |
Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O* | 4 μL |
ddH2O | 4 μL |
Total | 20 μL |
注：1）每個反應至少設置 3 個平行；2）推薦進行 20 μL 反應體系，如需進行 10 μL 反應，則將體系各組分等比減少；3）*在陰性對照反應管中加入ddH2O；在樣品反應管中加入稀釋后的文庫；在標準曲線反應管中加入DNA Standards；4）根據儀器選擇合適的ROX，推薦使用量為 0.5 μL。
四、qPCR 運行程序
將反應管置于 qPCR 儀中，按下述條件（如下表）設置 qPCR 反應程序，并運行（熔解曲線可根據儀器默認即可）。
溫度 | 時間 | 循環數 |
95℃ | 5 min | 1 cycle |
95℃ | 30 sec | 35 cycles |
60℃ | 45 sec* | |
95℃ | 15 sec | 1 cycle |
60℃ | 60 sec | |
95℃ | 15 sec |
注：*若文庫平均長度超過600 bp，應將退火延伸時間由45 sec延長至90 sec。
五、數據分析
1.標準曲線制作
1)根據復孔間 Ct 差異≤0.2 的原則，對 DNA Standards 原始 Ct 進行過濾，并計算平均 Ct。
2)使用有效范圍內的 Ct（作為縱坐標）和 Log[pM]（作為橫坐標）繪制標準曲線。參照 NTC 陰性對照 Ct 確認標準曲線 Ct有效范圍。
若 Ct (NTC) > Ct（DNA Standard 6）+ 3，則最大有效 Ct 為 Ct（DNA Standard 6），應使用 DNA Standard 1-6 所產生的 Ct 繪制標準曲線；
若Ct（DNA Standard 6）+ 3 > Ct (NTC) > Ct （DNA Standard 5）+ 3，則最大有效 Ct 為Ct （DNA Standard 5），應使用 DNA Standard 1-5 所產生的 Ct 繪制標準曲線；
若Ct（DNA Standard 5）+ 3 > Ct （NTC）> Ct（DNA Standard 4）+ 3，則最大有效 Ct 為Ct（DNA Standard 4），應使用 DNA Standard 1-4 所產生的 Ct 繪制標準曲線；
基于定量準確性考慮，請至少使用 4 個 Ct（DNA Standards）繪制標準曲線。若 Ct （DNA Standard 4）+ 3 > Ct （NTC），提示定量體系存在嚴重污染，需更換體系中所有組分后重復試驗。
3)繪制的標準曲線相關系數 R2 應不低于 0.99，斜率應位于 -3.1 至 -3.6 之間（表示擴增效率位于 90%-110% 之間）。如標準曲線參數不佳，應重復試驗。
2.文庫長度矯正
稀釋文庫的 Ct 只有位于標準曲線有效 Ct 范圍之內才可用于濃度計算，同時應對文庫進行長度矯正。可根據下述公式計算原始文庫濃度（nM）：
原始文庫濃度（nM）= [450 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）× 稀釋倍數/1000
六、使用案例
用 Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜鹽桿菌基因組 DNA 文庫，文庫 GC 含量為 70%，長度450 bp。將文庫稀釋 10000 倍上機檢測，結果如下圖所示。根據標曲及公式，文庫終濃度=4.37 pM × 稀釋倍數 10000=43.7 nM。
HB210510
