聯系電話
- 聯系人:
- 曹女士
- 電話:
- 400-6111-883
- 手機:
- 售后:
- 4006-111-883
- 傳真:
- 86-21-34615995
- 地址:
- 上海市浦東新區天雄路166弄1號3樓
- 網址:
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,制藥 |
---|
產品簡介
潮霉素B(Hygromycin B)是由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素,通過干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成,從而殺死原核(如細菌)、真核(如酵母菌,真菌)和高等哺乳動物真核細胞。
大腸桿菌( Escherichia coli.)來源的潮霉素抗性基因(hyg或hph),編碼潮霉素B磷酸轉移酶,將潮霉素B轉化成不具有生物活性的磷酸化產物,從而起到解毒作用。針對這一原理,潮霉素B是一種非常有用的選擇性標記,用來篩選和維持培養成功轉染潮霉素抗性基因的原核或者真核細胞。另外,由于作用模式的差異,常與G418 (Geneticin),Zeocin和Blasticidin S聯合使用進行雙抗性陽性細胞株的選擇。潮霉素B還能用作抗病毒劑,因其選擇性滲透進入因病毒感染增強通透性的細胞,且具有抑制翻譯的功效。還可混合入動物飼料中起到驅蟲功能。
產品信息
貨號 | 60225ES03 / 60225ES10 |
規格 | 1 g /10 g |
CAS號(CAS NO.) | 31282-04-9 |
分子式(Molecular Fomular) | C20H37N3O13 |
分子量(Molecular Weight) | 527.52 g/mol |
純度(Purity) | >90% by HPLC |
溶解性(Solubility) | 易溶于水 |
活力(Potency) | ≥1050 U/mg |
結構(Structure) |
組分信息
組分名稱 | 60225ES03 | 60225ES10 |
規格 | 1 g | 10 g |
儲存條件
-25~-15℃保存,有效期2年。
使用說明
1. 儲存液的配制(50 mg/mL)
稱取0.5 g 潮霉素B加入10 mL 1×PBS,PH 7.4,充分溶解后用0.22 μm濾器過濾除菌,分裝成單次使用的小量(如1 mL)放到-25~-15℃凍存,1年穩定。
2. 常用篩選濃度
潮霉素B用來篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞類型、培養基、生長條件和細胞代謝率而變化,推薦使用濃度為50-1000 μg/mL。對于第一次使用的實驗體系建議建立殺滅曲線(kill curve),即劑量反應性曲線,來確定最佳篩選濃度。
一般而言,哺乳動物細胞50-500 μg/mL;細菌/植物細胞20-200 μg/mL;真菌300-1000 μg/mL。
3. 殺滅曲線的建立
為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株,需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素濃度,可通過建立殺滅曲線(劑量反應曲線)來實現,至少選擇5個濃度。
1)第一天:未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上,37℃,CO2培養過夜。【注】:對于需要更高密度來檢測活力的細胞,可增加接種量。
2)根據細胞類型,設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例,可設定50,100,250,500,750,1000 μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/mL,然后按照下表稀釋到相應濃度的工作液。
終濃度(μg/mL) | 培養基體積(mL) | 5 mg/mL潮霉素B加入體積(mL) |
50 | 9.9 | 0.1 |
100 | 9.8 | 0.2 |
250 | 9.5 | 0.5 |
500 | 9.0 | 1.0 |
750 | 8.5 | 1.5 |
1000 | 8.0 | 2.0 |
3)第二天:替換舊的培養基,換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個濃度做三個平行孔。
4)接下來每3-4天更換新的含藥物培養基。
5)按照固定的周期(如每2天)進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(通常是7-10天)內能夠殺死絕大多數細胞的濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。
4. 穩定轉染細胞的篩選
1)轉染48 h后,用含有適當濃度的潮霉素B篩選培養基來傳代細胞(直接傳代或者稀釋后傳代)。【注】:細胞處于活躍分裂狀態時抗生素的殺傷。則當細胞過于稠密,其效率會降低。為了得到較好的篩選效果,將細胞稀釋至豐度不超過25%。
2)每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養液。
3)篩選7天后觀察并評估細胞克隆(集落)的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間,這取決于宿主細胞類型,轉染,以及篩選效果。
4)挑取并轉移5-10個抗性克隆于35 mm細胞培養板,繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。
5)之后更換正常培養基培養即可。
注意事項
1. 潮霉素B的抗性基因(hyg或hph)除了來自E. Coli.外,還發現于其他的菌株,包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。
2. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3. 本產品僅用于科研用途,禁止用于人身上。