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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,制藥 |
|---|
產品介紹
產品簡介
GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一種GST標簽蛋白純化樹脂，可以一步純化各種表達系統中-S-轉移酶、依賴性蛋白和重組衍生物。在結構上，該樹脂是以高度交聯的4%瓊脂糖凝膠為基質，通過12個原子的間隔臂，用化學方法共價結合還原型制作而成，具有更高的物理化學特性，可以耐受更高的壓力，在相對較高的流速下，實現對目的蛋白的純化，更適于工業大規模蛋白的純化。
GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 1 mL是裝填了GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的一種中壓預裝柱，規格1 mL，預裝柱具有標準接口，可以適配商品化的各類中壓色譜系統，如?KTA 等，方便客戶操作。
產品信息
貨號 | 20509ES03/20509ES08 |
規格 | 1 mL /5×1 mL |
產品性質
基質（Matrix） | 高度交聯的4%瓊脂糖微球 |
配體（Ligand） | 通過12原子間隔臂偶聯的 |
粒徑（Bead size） | 45-165 µm |
載量（Capacity） | >10 mg GST蛋白（40 kDa）/mL基質 |
最大壓力（PressureMax） | 0.3 MPa，3 bar |
pH穩定范圍（pH range） | 3-12 |
儲存緩沖液（Buffer） | 含20%乙醇的1×PBS |
儲存條件
2~8℃保存，有效期2年。
需準備試劑
所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。
平衡/洗雜緩沖液：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4
洗脫緩沖液：用平衡液配制10 mM 還原型（現配現用）
【注】平衡/洗雜緩沖液或洗脫緩沖液中可加入1-10 mM DTT。
使用說明
【注】樣品在上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，減少雜質以防阻塞柱子。
1. 樣品純化（以Akta為例）
1）準備：將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統中。再折斷下口，將預裝柱接到色譜系統中，并旋緊。
2）清洗：3-5倍柱體積去離子水沖洗層析柱中儲存液。
3）平衡：用5倍柱體積的平衡Buffer平衡層析柱，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護蛋白的作用。
4）上樣：將樣品加到平衡好的層析柱中，推薦流速1 mL/min，保證目的蛋白與樹脂充分接觸，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待檢測。
注意：樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會導致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。
5）洗雜：用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進行清洗，直到紫外吸收達到一個穩定的基線，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液，待檢測。
6）洗脫：用洗脫Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常5倍柱體積洗脫液足夠將目的蛋白洗脫下來。也可以用一個小的梯度，例如20倍柱體積或更多，來分離不同結合強度的蛋白質。
7）清洗與保存：依次使用3倍柱體積的平衡Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，最后用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%乙醇中，置于4℃保存，防止填料被細菌污染。
2. SDS-PAGE檢測
將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進行檢測，判定其純化效果。
3. 填料清洗
GST標簽蛋白純化產品可以重復使用而無需再生，但隨著非特異結合蛋白的增多和蛋白的聚集，會造成流速和結合載量性能下降，此時需對填料進行清洗。
1）去除一些沉淀或變形物質
用2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進行清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。
2）去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質
用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。
注意事項
1.請勿冷凍保存本產品。
2.所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。
3.本產品僅作科研用途。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
附表 問題及解決方案
問題 | 可能原因 | 推薦解決方案 |
柱子反壓過高 |
填料被堵塞 | 清洗樹脂 |
裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，或離心去除 | ||
樣品太黏稠 | 樣品中含高濃度的核酸，延長破碎時間直至粘度降低，或添加DNaseI （終濃度為5 µg/mL），Mg2+（終濃度1 mM），冰上孵育10-15 min | |
緩沖液太黏稠 | 有機試劑或蛋白穩定試劑（如甘油等）可能會引起反壓增高，降低操作流速 | |
洗脫組分中無目的蛋白 | GST標簽蛋白變性了 | 使用溫和的裂解條件，實驗條件以經驗為準 |
過度的裂解使目的蛋白變性 | ||
目的蛋白聚集產生沉淀 | 在細胞裂解前溶液中加入DTT，終濃度為1-10 mM | |
融合蛋白改變了GST的構象，影響了目的蛋白的結合力 | 測定pGEX中GST的結合力，對載體進行超聲處理，檢測其結合力。如果載體中GST有很高的親和力，有可能是改變融合蛋白的構象從而降低了GST標簽蛋白的親和力 | |
降低結合溫度至4℃，充分清洗 | ||
柱子平衡時間太短，目的蛋白不是在pH 6.5-pH 8.0范圍內結合 | 用pH 6.5-pH 8.0的buffer進行充分的平衡，如PBS | |
目的蛋白沒有洗脫下來 | 洗脫體積太少 | 增加洗脫液體積，減小洗脫流速。 |
洗脫液中濃度太低 | 增加洗脫液中還原型濃度，可嘗試用20-40 mM還原型洗脫。 | |
低pH影響洗脫 | 在不增加洗脫液中量時，提高洗脫液中pH至pH 8-9會有改善 | |
增加洗脫液中離子強度，如0.1-0.2 M NaCl | ||
洗脫液中被氧化 | 使用新鮮配制的洗脫液 | |
加入DTT | ||
非特異性疏水作用影響目的蛋白的溶解和洗脫 | 洗脫液中加入非離子型洗滌劑，如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 | |
電泳或Western Blot檢測中發現多條帶 | Mr 70000蛋白與目的蛋白一起純化下來 | Mr 70000蛋白可能是大腸桿菌基因DnaK的產物，可以在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl，2 mM ATP，10 mM MgSO4，pH 7.4在37℃加熱10min去除 |
可通過ATP-瓊脂糖膠或離子交換來去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 | ||
GST融合蛋白已經發生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制劑，如加入1 mM PMSF | |
可能是蛋白酶對目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT） | ||
細胞破碎過度 | 減少細胞破碎時間，超聲前加入（菌液體積的0.1倍10 mg/mL，25 mM Tris-HCl，pH 8.0），避免發泡導致蛋白酶變性，過度超聲破碎增加宿主內源蛋白與GST融合目的蛋白的共純化。 | |
共價共純化 | 包括促進蛋白正確折疊的分子伴侶的共純化，如：DnaK（Mr～70000），DnaJ（Mr～37000），GrpE（Mr～40000），GroEL（Mr～57000），GroES（Mr～10000） | |
抗體與E. coli的各種蛋 白反應 | 抗體吸附E. coli蛋白：GST-抗體；超聲處理去除GST抗體，可以用Western Blot檢測 |
