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產品簡介
| 供貨周期 | 兩周 | 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
|---|
產品介紹
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細胞進行RNA提取（如cell line 化的貼壁細胞和懸浮細胞、原代培養細胞、各種干細胞、iPS 細胞等），無需提RNA，可直接進行qPCR表達分析，用時短，操作簡單，出錯率低，最短只需1.5小時就可高效完成從模板制備到反轉錄反應及基因表達分析等步驟。該產品為染料法細胞直擴RT-qPCR試劑盒的細胞裂解模塊，為補充試劑。
組分信息
組分編號 | 組分名稱 | 16811ES40 | 16811ES60 |
16811-A | FCD Lysis Buffer | 2 mL | 5 mL |
16811-B | FCD Washing Buffer | 8 mL | 20 mL |
16811-C | FCD Stop Solution | 100 μL | 250 μL |
16811-D | DNase I | 80 μL | 200 μL |
儲存條件
16811-A和 16811-B未開封時請置于-25~-15℃保存，融解后置于4℃保存，注意防止污染，其余組分長期保存時請于-25~-15℃保存，有效期6個月。
使用說明
一、裂解產物的制備
將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導致反應性能下降。
將細胞轉移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細胞**，充分吸除培養基。若貼壁細胞在96孔板中培養，可直接吸除培養基。
各個孔內加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產物****，細胞數量超過1× 105 cells時可能會有裂解殘留物屬正常現象。
*50 μL裂解體系適配細胞數的基本要求是每孔1× 104，該試劑盒可使用范圍是1 × 103 - 1 × 106 cells，若細胞數量較多，可適當等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同細胞的離心條件不同，請使用適合于所用細胞的離心速度進行離心。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要，加入裂解液量增大時需相應增大FCD Stop Solution的量。
****細胞裂解產物溶液長期保存時，請置于-25~-15℃。
二、反轉錄
室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應體系：
組分 | 體積 （μL） | 終濃度 |
4× Hifair® FCD RT Mix | 5 | 1× |
裂解產物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表1 反轉錄反應體系
*避免吸入細胞碎片，推薦使用量為2-5 μl，最大不超過反應體系的45%。
移液器輕輕混勻上述配制的反應液，按下表程序進行反轉錄反應**：
反應溫度 | 反應時間 |
55℃ | 15 min |
85℃ | 5 min |
表2 反轉錄反應程序
**反轉錄溫度推薦使用55℃，對于高GC含量模板或者復雜模板，可將反轉錄溫度提高到 60℃。反轉錄產物可直接進行下游RT-qPCR檢測。為避免反轉錄體系對qPCR反應的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內不進行下游實驗，可放置于-25~-15℃保存。
三、熒光定量PCR
體系配置
使用下列組份比例配制反應液（配制過程請于冰上進行）：
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix | 10 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.4 | 200 nM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.4 | 200 nM |
反轉錄產物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表3 qPCR反應體系
*反轉錄產物的加入量不要超過RT-qPCR體積的1/10。高濃度模板易導致非特異擴增，適當稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL，盡量不要超過6 μL。反應性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內調整引物濃度。
熒光定量PCR常規擴增程序（推薦）
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 35-40 |
退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設置 | 1 | |
表4 qPCR反應程序（常規）
熒光定量PCR快速擴增程序
實驗條件允許時，也可使用快速程序進行擴增。
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 40 |
退火/延伸** | 60℃ | 10 sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設置 | 1 | |
表5 qPCR反應程序（快速）
**退火/延伸溫度、終延伸時間可根據實驗要求適當調整。 快速程序適用于絕大多數基因，個別復雜二級結構基因可嘗試常規程序。
注意事項
使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。
本產品避免反復凍融，配制時應避免強光照射。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
本產品僅作科研用途！
