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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
|---|
產品介紹
Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit是利用新一代拓撲異構酶(Topoisomerase)高效快速連接DNA片段的原理進一步研發而成，搭配高效的平末端化因子，兼容平末端產物及粘性末端產物的快速克隆。與傳統的連接酶相比，具有以下優勢：1) 快速，僅需5分鐘即可完成連接反應。2) 高效，無自連現象，陽性克隆率接近100%，無需設置藍白斑篩選；3) 可連接長達5 kb目的產物。
組分信息
組分編號 | 組分名稱 | 10906ES08 | 10906ES20 | 10906ES50 |
10906-A | 2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix | 25 μL | 100 μL | 250 μL |
10906-B | 1 kb control insert (40 ng/μL) | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
10906-C | M13 Forward Primer(10 μM) | 50 μL | 200 μL | 500 μL |
10906-D | M13 Reverse Primer(10 μM) | 50 μL | 200 μL | 500 μL |
儲存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用說明
反應體系
組分 | 用量 |
2× Hieff Clone® Universal TOPO Cloning Premix | 5 μL |
插入片段* | 0.5-5 μL |
ddH2O | To 10 μL |
*PCR 產物不能磷酸化。如擴增模板為質粒，模板質粒會在后續實驗中引起假陽性，因此推薦PCR產物進行膠回收后連接。0.1-1 kb片段投入量推薦20-50 ng，1-2 kb片段投入量推薦50-100 ng，2-4 kb片段投入量推薦100-200 ng，4-5 kb片段投入量推薦200-300 ng。
反應條件
混勻上述體系，于室溫(20-37℃)反應5 min。連接反應不可于冰上進行。室溫(20-37℃)下孵育時，建議孵育時間不超過5 min，如果PCR產物濃度較低或者片段較長，則可以適當延長孵育時間，不宜超過15 min（推薦使用25℃，PCR儀控溫）。
轉化
1）在冰上解凍克隆感受態細胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802ES）。
2）取10 μL冷卻重組產物，加入到100 μL感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置25 min。
3）42℃熱激60 sec，冰上孵育2 min。
4）加入500 μL SOC或LB培養基，37℃，200 rpm，搖菌60 min。
5）5000 rpm離心4 min，棄上清至100 μL，用剩余培養基重懸菌體。用無菌涂布棒將菌液均勻涂抹在含有正確抗性的平板上。待菌液被培養基吸收后，倒置平板，于37℃過夜培養。
克隆鑒定
可選擇測序法或酶切法進行鑒定。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接進行PCR反應。測序引物：
M13F ：GTAAAACGACGGCCAGT
M13R ：CAGGAAACAGCTATGAC
載體信息
注意事項
需自備的材料：
1）自備試劑（僅羅列部分）：
超級感受態：轉化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超級感受態細胞（Cat#11802ES）。
高保真酶：2× Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10154ES）或其他等效產品。
菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效產品。
核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效產品。
2）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
本產品僅作科研用途！
