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供貨周期 | 一周 | 規格 | 50T |
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貨號 | XY-1032 | 應用領域 | 醫療衛生,環保,化工,生物產業,農業 |
主要用途 | 熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。 |
玉米晚枯病菌PCR試劑盒
Cephalosporium maydis PCR Kit
產品簡介:
熒光定量 PCR 是檢測傳染性疾病的主流技術,本產品就是以染料法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測玉米晚枯病菌的試劑盒。
產品特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物經過優化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據玉米晚枯病菌高度保守的 VP1 區設計。
5. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
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產品名稱 | 方法 | 規格 | 價格 |
玉米晚枯病菌LAMP試劑盒 | LAMP | 50次 | 2490元 |
玉米晚枯病菌 PCR試劑盒 | PCR | 50次 | 1490元 |
玉米晚枯病菌染料法熒光定量PCR試劑盒 | 染料法 | 50次 | 2490元 |
玉米晚枯病菌探針法熒光定量PCR試劑盒 | 探針法 | 50次 | 2990元 |
玉米晚枯病菌PCR試劑盒包裝規格及成分:
編號 | 成分 | 規格 |
試劑一 | 2×PCR MagicMix | 0.5 mL(棕色) |
試劑二 | 熒光 PCR 模板稀釋液 | 1 mL(黃蓋) |
試劑三 | 玉米晚枯病菌PCR 引物混合液 | 100 μL(白蓋) |
試劑四 | 玉米晚枯病菌PCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL(紅蓋) |
試劑五 | DNA 病毒裂解液試用裝 | 15 次(9 mL) |
試劑六 | 使用手冊 | 1 份 |
運輸及保存:低溫運輸,-20℃保存,有效期一年。
自備試劑:DNA 模板
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使用方法:
一.稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。
3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二.樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個樣品,必須設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 上步制備的標準曲線樣品的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當于 1 萬拷貝)或第 5 號(濃度為 1×10E5 拷貝/μL,10μL 相當于 10 萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為 PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要 200μL 樣品,則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
8.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。?
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 94℃ | 5 min |
PCR 反應 (35 個循環) | 94℃ | 0.5 min |
50℃ | 0.5 min(采集 SYBR 通道的 熒光信號) | |
72℃ | 0.5 min | |
后延伸 | 72℃ | 10 min |
三、設置 qPCR 反應(20 μL 體系,在樣品制備室進行)
9.如果只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于標準曲線樣品。如果做 2-3次重復,則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。
10.在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加):
成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | 標準曲線 樣品管(2-7 管) |
2×qPCR MagicMix (棕色管) | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
玉米晚枯病菌PCR 引 物混合液(白蓋) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
待測樣品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第 7 步所得標準曲線樣 品稀釋液(2-7 號) | 不加 | 不加 | 各 6μL(2 號樣到 2 號管,3 號樣到 3 號管…) |
11.蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 PCR(具體 PCR 參數可以根據儀器不同 而自行優化)。
四、熒光定量 PCR 反應參數
五、數據處理
12.以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
六、電泳檢測
13.如果有必要電泳確認,可取 10-20 uL PCR 產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產 物的大小為 400 bp。
熒光定量PCR結果分析:
一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化;在平臺期,擴增產物已不再呈指數級增加,PCR終產物量與起始模板量之間沒有線性關系,無法計算起始模板拷貝數。因此只有在熒光信號指數擴增階段,PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系,故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便,在實時熒光定量 PCR 技術中引入了幾個重要的概念:擴增曲線、熒光閾值、CT值。
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