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果汁中嗜熱嗜酸菌的檢測方法——膜過濾法和涂布法
閱讀:2077 發(fā)布時間:2018-9-30
◆背景
此方法用于分析檢測果汁成品或原料。此文件細節(jié)性地描述了嗜熱嗜酸菌(以下縮寫為TAB)的定量檢測和其確認測試。此文件含有關于TAB的定義,描述和其他的相關信息。
◆原理
在濃縮果汁,特定甜味劑和一些飲料中,TAB(脂環(huán)酸芽孢桿菌)主要以孢子的形式存在。這些孢子的活性往往在高溫殺菌,并且有合適的生長環(huán)境的條件下增長。TAB不會在冷飲中生長。如果環(huán)境允許,TAB會生成一種名為愈創(chuàng)木酚的化合物。此化合物會給產(chǎn)品和原料帶來一種藥的味道?;诖怂幬叮瑯悠繁徽J為是腐壞了。
◆原料和標準品
a.酵母提取物(212759,BD)
b.葡萄糖(215530,BD)
c.可溶性淀粉(217820,BD)
d.瓊脂(214530)
e.愈創(chuàng)木酚測試套裝
◆儀器設備
a.水浴鍋
b.培養(yǎng)箱
◆實驗過程
a.培養(yǎng)基(YSG)配制
i.溶液A:在1L燒杯中稱量2g酵母提取物,1g葡萄糖和2g可溶性淀粉。加入500mL去離子水溶解。加入適量1N的鹽酸或硫酸,使pH調(diào)整至3.7±0.1。
ii.溶液B:取一個新的1L的燒杯。稱量15g瓊脂并加入500mL去離子水加熱溶解。
iii.在121°C下蒸汽滅菌15分鐘。
iv.當溶液A和B的溫度都降至47±0.2°C時,在無菌條件下將溶液A倒入溶液B中混合。
v.在培養(yǎng)皿中倒入15至20mL配置完成的培養(yǎng)基(YSG)并使其凝固。將澆好的培養(yǎng)皿放入冰箱中存放。保質(zhì)期為一個月。
b.樣品準備(熱擊)
i.在試管中準備9mL的無菌水,在無菌條件下加入1mL濃縮果汁并混勻。
ii.將試管置于80°C水浴鍋中熱擊。當樣品溫度到達80±0.2°C時計時10分鐘。然后快速降溫至室溫。
iii.如果樣品為單倍果汁,則無需稀釋。
c.樣品分析方法
i.涂布法(用于不可過濾的樣品):
1.向固體YSG培養(yǎng)基中加入1mL熱擊過的稀釋樣品(單倍果汁無需稀釋,直接取1mL樣品)。將樣品均勻涂抹在培養(yǎng)基表層。
2.將平板正放于45±2°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天。
3.一天后倒置平板并繼續(xù)培養(yǎng)4天。
ii.膜過濾法(用于可過濾樣品):
1.在50mL無菌水中加入熱擊過的稀釋樣品(單倍果汁無需稀釋,直接取10mL樣品加入)。混勻后用0.45µm濾膜過濾。
2.在無菌條件下將濾膜轉(zhuǎn)移至固體YSG培養(yǎng)基上。
3.倒置平板,在45±2°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。
d.結(jié)果分析
i.如果樣品中菌落計數(shù)小于原料標準要求,用愈創(chuàng)木酚測試套裝進一步檢測會有無產(chǎn)生鄰甲氧基苯酚的微生物。如果菌落計數(shù)大于原料標準要求,則直接認定為不合格樣品。
ii.陽性平板應通過顯微鏡鏡檢來確定脂環(huán)酸芽孢桿菌的存在。
iii.每一套測試樣品需要有控制平板做比對。包括空氣,陽性菌對比,YSG培養(yǎng)基和樣品所使用的無菌水。
e.愈創(chuàng)木酚測試套裝
i.用接種環(huán)取10 µL不含孢子的新鮮菌落,懸浮于含有“Va-YSG 試劑 (2mL)”的試管中(≥1×108cfu/mL)。
ii.在45±1°C下培養(yǎng)3小時或過夜。
iii.加入1mL鄰甲氧基苯酚測試套裝試劑1。
iv.加入20µL鄰甲氧基苯酚測試套裝試劑2。
v.加入20µL鄰甲氧基苯酚測試套裝試劑3。
vi.混勻并放置5-10分鐘。
vii.觀察溶液的顏色變化。在10分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。
viii.陽性控制:取2mL純凈水和100µL陽性控制并混合。重復步驟iii-vii。
ix.空白:取新的“Va-YSG”試劑并重復步驟ii-vii。
◆質(zhì)量控制檢測
a.這項測試需要含有少量TAB陽性菌的可過濾果汁樣品作為過程檢查。
b.向10mL離心管中加入1mL陽性樣品(濃縮)。加入9mL無菌水或緩沖劑。
c.80±2°C熱擊10分鐘。
d.取1mL樣品至50mL無菌水中混合。
e.過濾并把陽性控制儲藏在冷凍(-18°C)條件下。
產(chǎn)品信息鏈接:愈創(chuàng)木酚測試套裝