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再生醫學之細胞外囊泡療法的新型工具箱
閱讀：1302 發布時間：2021-1-22
使用PS親和法分離的MSC來源細胞外囊泡具有較高的抗炎和抗纖維化作用
細胞外囊泡（EVs）是由細胞釋放的微小脂質雙分子層顆粒。如今，細胞外囊泡由于可以傳遞生物活性脂質、蛋白質和核酸，被*為是細胞間通訊的重要信使。間充質干細胞（MSC）來源的細胞外囊泡，正成為未來再生醫學中頗具前景的治療策略。本文將介紹一種細胞外囊泡分離技術——PS親和法，以及目前為止在再生醫學中發現的實用性。
◆細胞外囊泡（EVs）
細胞外囊泡，包括外泌體和微囊泡，是由細胞釋放的小于1,000 nm的脂質雙層顆粒，同時帶有標記蛋白CD9、CD63和CD811）。細胞外囊泡包含蛋白質、DNA、RNA和脂質等細胞成分，被認為是通過轉移這些成分來進行細胞間的交流。
◆MSC來源細胞外囊泡
MSC是來源于間充質的干細胞，可以分化為脂肪、骨骼和軟骨。MSC可以從骨髓、脂肪組織或臍帶建立，使其成為有前景的未來再生醫學的來源。已知MSC具有某些旁分泌效應，包括免疫抑制、抗炎和抗纖維化。近的報告顯示，這些影響是由MSCs釋放的細胞外囊泡（EVs）引起的3），這也是MSC來源細胞外囊泡（EVs）療法受到關注的原因。
◆新型細胞外囊泡（EVs）分離技術-PS親和法-
分離細胞外囊泡包括以下幾種方法：已經經過長期應用的超速離心、密度梯度離心及針對表面抗原的抗體親和法4）。但是以上方法存在諸如回收率低、純度低、不能收集完整囊泡、再現性差等問題。 對此，富士膠片和光與金澤大學的華山教授合作共同開發了一種新的PS親和法，該方法可捕獲表達于細胞外囊泡表面的磷脂酰絲氨酸（PS）5）。PS親和法利用的是與PS鈣依賴性結合的Tim4蛋白。Tim4蛋白雖能與PS牢固結合，但也可由Ca2+螯合劑（如EDTA）釋放。利用該特性，可開發出比傳統方法的回收效率、純度、收集完整囊泡和可重復性更佳的細胞外囊泡分離方法（圖1）。
圖1
A）通過PS親和法進行的細胞外囊泡步驟
B）通過PS親和法或UC分離EVs的透射電子顯微鏡圖。箭頭表示EVs。
◆PS親和法可分離具有高活性的MSC來源細胞外囊泡
接下來要介紹的是我們近在分離MSC來源細胞外囊泡中發現到的PS親和法的價值。首先，通過PS親和法或超速離心法（UC）從骨髓來源的MSC條件培養基中分離出細胞外囊泡。然后，通過PS ELISA比較每種分離方法的回收效率，一種PS親和技術的細胞外囊泡定量法（圖2A）。通過檢測CD9、CD63或CD81分析細胞外囊泡的定量。結果顯示，UC回收率為40％，而PS親和法回收率為80％以上（圖2B）。
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圖2
A）PS ELISA的原理
這是一種對細胞外囊泡進行定量的原創性技術，通過固定化Tim4蛋白和檢測抗體分別實現捕獲細胞外囊泡和檢測細胞外囊泡的表面抗原。
B）通過PS親和法或UC法分離的MSC來源細胞外囊泡的定量檢測
檢測抗體是抗CD9抗體、抗CD63抗體或抗CD81抗體。該圖顯示的是相對值，其中培養基的細胞外囊泡數量為100％。
PS ELISA法：PS CaptureTM外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP）（298-80601；包括抗CD63抗體），抗CD9抗體（019-27953），抗CD81抗體（011-28111）。
此外，我們比較了每種方法分離出來的MSC來源細胞外囊泡活性并進行實驗，以評估外周血單個核細胞（PBMC）的抗炎作用和正常人胎兒肺二倍體成纖維細胞（TIG3細胞）的抗纖維化作用。結果表明，通過PS親和法分離的MSC來源細胞外囊泡比通過UC分離的細胞外囊泡具有更高的活性（圖3、4）。
圖3. MSC來源的細胞外囊泡對LPS誘發的炎癥的作用
用LPS刺激由PBMC分離出的單核細胞來誘導炎癥，然后添加由各方法分離出的4.5×108粒子/ mL細胞外囊泡。結果發現，MSC來源的細胞外囊泡抑制了TNFα和IL-6基因表達的增強以及TGFβ基因表達的降低。PS分離的細胞外囊泡比UC分離的細胞外囊泡更具抑制作用。
圖4. MSC來源的細胞外囊泡對纖維化的影響
用TGFβ刺激TIG3細胞并誘導纖維化相關基因增強表達，隨后添加由各方法分離的1×109 粒子/ mL的細胞外囊泡。MSC來源的細胞外囊泡抑制了膠原III、αSMA和膠原V基因的升高，PS分離的細胞外囊泡比UC分離的細胞外囊泡更具抑制作用。
這個結果顯示，PS親合法能夠以高回收率分離MSC來源的細胞外囊泡，同時保持細胞外囊泡的高活性。換言之，它揭示了傳統方法除回收率低外，還因超速離心的物理損傷引致細胞外囊泡的功能的損害。我們的PS親和法有望成為未來細胞外囊泡療法的創新技術。
◆結論
綜上所述，盡管基于細胞外囊泡的療法在再生醫學領域正備受關注，但經典方法（例如超速離心）仍被廣泛用于分離細胞外囊泡6）。PS親和法是一種理想的方法，可解決傳統方法帶來的問題，例如回收效率低及降低細胞外囊泡的活性等。該試劑盒具有出色的回收效率、純度、收集完整細胞外囊泡的能力及可重復性。不難設想，未來的再生醫學將需要優化的細胞外囊泡分離方法，希望本文的PS親和法將是實現這一目標的強大工具。
◆產品列表
產品編號 | 產品名稱 | 規格 |
299-77603 | MagCapture™外泌體分離試劑盒PS | 2 tests |
293-77601 | 10 tests | |
297-79201 | PS Capture™外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD） | 96 tests |
298-80601 | PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests |
◆視頻
2020年ISEV研討會：如何使用 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS
復制鏈接觀看視頻：labchem.fujifilm-wako.com.cn/resources/show/56.html
[用于分離和檢測間充質干細胞來源的細胞外囊泡的PS親和力的特性]。
復制鏈接觀看視頻：labchem-wako.fujifilm.com/us/wako-blog/videos/2020-07-08%2009-40-45.mp4
◆產品資料
復制鏈接下載產品彩頁（labchem.fujifilm-wako.com.cn/pdf/show/120.html），或向當地代理商索要紙質版本。
◆參考文獻
1. | Colombo et al., Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of Extracellular vesicles and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 30 : 255-289 （2014）.
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2. | Mathieu et al., Specificities of secretion and uptake of Extracellular vesicles and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol, 21（1） : 9-17 （2019）
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3. | Phinney and Pittenger, Concise Review : MSC-Derived Extracellular vesicles for Cell-Free Therapy. Stem Cells, 35（4） : 851-858 （2017）
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4. | Thery et al., Isolation and characterization of Extracellular vesicles from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol Chapter 3, Unit 3 22 （2006）
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5. | Nakai et al., A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci Rep 6 : 33935 （2016）
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6. | Fujita et al., Clinical Application of Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Inflammatory Lung Diseases. J Clin Med 7（10） : 355 （2018） |