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內毒素檢測：從凝膠法到動態法
閱讀：623 發布時間：2022-9-16
◆內毒素檢測的意義
內毒素在環境中無處不在，主要在細菌裂解過程中由革蘭氏陰性菌的外膜釋放。若細菌內毒素通過腸胃外途徑進入人體，可能會導致發生炎癥、感染性休克、出血甚至死亡1。此外，在研究應用中，內毒素污染會導致研究結果不準確并有可能產生誤導性的解釋。因此，內毒素檢測已成為注射藥物和醫療器械開發及質量控制的重要組成部分。
◆鱟試劑（LAL）檢測，內毒素檢測的良好選擇
目前已有多種內毒素檢測方法。其中，鱟試劑檢測法（LAL）被確立為內毒素檢測的金標準試驗2，3。LAL檢測依賴于從鱟血液中提取的蛋白與樣品孵育、反應從而分析內毒素含量。如果所測樣品含有內毒素，LAL中的促凝血酶會與其發生相互作用，導致凝血級聯反應的激活、變形細胞凝血原的修飾以及凝膠的形成，這被稱為凝膠法。對形成的凝膠可進行目視定性評估。雖然凝膠法靈敏且方便，但無法進行內毒素定量檢測和高通量分析。因此，人們開始關注定量的LAL檢測法。
◆動態鱟試劑檢測的發展及優勢
動態LAL檢測具有顯著優勢，其可在廣泛的濃度范圍內定量內毒素含量并實現自動化分析，減少與用戶有關的檢測差異。內毒素定量可通過濁度（濁度法）或反應混合物的顏色變化（顯色法）進行評估。濁度法和顯色法均可以動態法或終點檢測法的方式進行檢測。
濁度法
動態濁度法鱟試劑PYROSTAR™ ES-F
濁度法可評估酶底物裂解后及凝膠形成前發生的濁度（渾濁）形成。使用分光光度計或酶標儀對濁度進行定量。濁度法可靠、靈敏且支持高通量分析。
顯色法
動態顯色法鱟試劑Limulus Color KY
顯色法的原理為鱟試劑使顯色底物裂解，從而導致發色團的釋放。然后，使用光度計對顯色反應進行定量。顯色法靈敏度高，可實現自動內毒素測量和高通量分析。
◆基于重組因子的定量分析
重組三因子鱟試劑PYROSTAR™ Neo
除了以上方法，內毒素的定量檢測還有重組C因子或多因子的檢測法。所使用的重組因子，包含了誘導內毒素的鱟凝血級聯反應中的一種或多種蛋白4。
◆變更為動態LAL檢測的注意事項
LAL檢測已被廣泛接受為內毒素檢測的標準測試2，3。盡管LAL檢測的所有變化都是靈敏、可靠的，但定量LAL檢測和基于重組因子C的檢測法，由于可提供定量和高通量內毒素的檢測而越來越受歡迎。為內毒素檢測選擇合適的定量分析方法時5，應綜合考慮分析樣品的性質和特點、可用設備以及可能相關的法規要求等多種因素。
◆文獻來源
[1] Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources 2018;52:115–120. https://doi.org/10.1016/j.anres.2018.08.002.
[2] Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.
[3] Mehmood, Y. What Is Limulus amebocyte lysate (LAL) and its applicability in endotoxin quantification of
pharma products. Growing and Handling of Bacterial Cultures. IntechOpen 2019.
Doi:10.5772/intechopen.81331.
[4] Suvarna, K. Endotoxin detection methods – Where are we now? American Pharmaceutical Review. 2015,
August 25.
[5] Wong J, Davies N, Jeraj H, Vilar E, Viljoen A, Farrington K. A comparative study of blood endotoxin detection in
haemodialysis patients. Journal of Inflammation (London) 2016;13:24. doi: 10.1186/s12950-016-0132-5.
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