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Western Blotting老踩坑?一篇搞定常見問題
閱讀:239 發布時間:2024-4-16◆Western Blotting實驗失敗緣由?
Western Blotting是生命科學研究的基礎實驗方法,實驗中的蛋白量、抗體、凝膠、膜和檢測反應等因素均可能導致實驗失敗,但初學者往往不知道原因所在。 “我不知道Western Blotting失敗的原因是什么“ “我想知道解決方案!“ 針對Western Blotting的各種問題,本文整理了在轉膜、抗體反應、檢測等過程中的常見問題及解決方案。 |
◆Western Blotting常見的失敗案例
以下為Western Blotting常見的失敗案例:
● 高背景
● 出現微笑條帶或扭曲條帶
● 出現漫反射帶
● 轉膜不均勻
下面將分別介紹它們的原因及相應的解決方案。
高背景
原因 | 解決方案 |
洗滌不充分 | ● 增加洗滌次數 ● 增加洗液體積 ● 延長洗滌時間 ● 確認Tween® 20 (*)濃度 |
無法阻斷非特異性結合 | ● 重新調節封閉溫度和時間。室溫下1 h,4℃下過夜 ● 添加Tween® 20 (*) ● 使用添加Tween® 20 (*)的封閉緩沖液(TBS-T、PBS-T) ● 使用高靈敏度發光試劑(Immunostar® 系列) |
膜處理不當 | ● 對膜進行必要的前處理 ● 使用干凈的鑷子和手套,注意不要損壞膜。 ● 孵育時振蕩 ● 使用低背景且可高靈敏度檢測靶蛋白的CLEARTRANS® 系列產品 |
因設備、器皿的污垢造成的污染 | ● 充分清洗轉膜裝置、電泳槽等設備,操作過程中佩戴手套 |
強化學發光信號 | ● 縮短檢測的曝光時間 ● 縮短檢測試劑的反應時間 ● 降低檢測試劑的濃度 |
(*) ICI Americans社的注冊商標
出現微笑條帶和扭曲條帶
原因 | 解決方案 |
電壓過高發熱 | ● 降低電壓進行電泳 |
鹽濃度不同 | ● 鹽濃度越高,移動速度越快,需統一樣品的鹽濃度 |
上樣量不同 | ● 統一各個孔的上樣量 |
有空孔 | ● 在空孔中上樣相同鹽濃度、相同液量的樣品,或僅上樣樣品緩沖液 |
出現漫反射帶
原因 | 解決方案 |
受到樣品溶液中變性劑和表面活性劑的影響 | ● 確認樣品的提取和制備過程 |
樣品存放時間久,存儲方法不當, 導致蛋白降解 | ● 確認樣品的制備時間和存儲方法 |
轉膜時間過短 | ● 如果所有條帶出現相同現象,可能是轉膜時間短,需要延長轉膜時間 |
蛋白量過高 | ● 調整蛋白上樣量和濃度 |
轉膜不均勻
原因 | 解決方案 |
凝膠和膜之間有氣泡 | ● 使用滾筒等去除氣泡 |
轉膜設備的問題 | ● 使用半干式設備時,反復使用會導致轉膜板彎曲,建議返廠維修或更換 新的設備 |
轉膜方法的問題 | ● 半干式設備容易引起轉膜不均勻的問題,可嘗試更換為濕轉儀 |
◆其他失敗案例的原因及解決方案
其他的失敗原因、解決方案如下所示。
● 條帶模糊、不清晰
● 條帶空白
● 信號弱、無信號
● 背景有斑點和污漬
● 麗春紅染色效果差
下面將分別介紹它們的原因及相應的解決方案。
條帶模糊、不清晰
原因 | 解決方案 |
蛋白量過高 | ● 降低電泳的蛋白量 |
抗體濃度高 | ● 降低一抗、二抗的濃度 |
檢測信號高 | ● 縮短曝光時間 ● 縮短檢測試劑的反應時間,反應后盡可能去除試劑 ● 降低二抗濃度 |
條帶空白
原因 | 解決方案 |
蛋白量高 | ● 減少蛋白量 |
抗體濃度高 | ● 降低一抗、二抗的濃度 |
信號弱、無信號
原因 | 解決方案 |
抗體失活 | ● 檢查抗體存儲狀態,時間 ● 重新進行抗體反應時,推薦使用10 min即可去除抗體的“WB膜再生液“ |
抗體結合力不足 | ● 確認抗體的稀釋濃度是否合適 ● 延長抗體反應時間 ● 對于低蛋白表達量的樣品,可增加電泳量,提高抗體濃度 ● 使用抗原抗體反應促進試劑 ● 更換高效轉膜緩沖液 |
疊氮-化鈉抑制酶反應 | ● 疊氮-化鈉會抑制HRP的活性,因此抗體中含疊氮-化鈉時,需要稀釋抗體 以降低疊氮-化鈉濃度或使用不含疊氮-化鈉的抗體 ● 使用HRP標記一抗且阻斷劑中含有疊氮-化鈉時,需在封閉后使用 TBS-T 清洗再進行抗體反應 |
曝光時間短 | ● 延長曝光時間 |
封閉時間不當 | ● 封閉時間過長時,封閉劑會遮蓋抗原,降低抗體反應性,因此需要確認封 閉時間是否合適 |
轉膜效率低,無法轉膜 | ● 延長轉膜時間 ● 靶蛋白的分子量較高時(例:100 kD以上),添加0.1%的SDS(十二烷基硫 酸鈉) ● 使用預染蛋白Marker作為陽性對照,確認轉膜效率 ● 使用具有抗體結合位點的分子量Marker作為陽性對照 |
檢測試劑的化學發光弱 | ● 確認檢測試劑是否變質 ● 使用高靈敏度的發光試劑“ImmunoStar®系列“ |
背景可見斑點和污漬
原因 | 解決方案 |
鑷子被污染 | ● 鑷子上的污垢會附著在膜上形成背景。需使用經乙醇消毒后的干凈鑷子 夾住膜的邊緣 |
洗滌不充分 | ● 增加洗滌次數和洗液體積 |
抗體反應不當 | ● 增加抗體反應溶液,并振蕩使其反應 |
檢測設備被污染 | ● 檢測前,使用乙醇擦拭放置膜的樣品臺,去除污垢 |
麗春紅染色效果差
原因 | 解決方案 |
蛋白未轉膜 | ● 確認轉膜設備是否正確運行 ● 確認膜和凝膠是否正確接觸 |
低蛋白量 | ● 增加蛋白的上樣量 |
染色試劑變質 | ● 檢查染色試劑的有效期 ● 更換凝膠染色試劑(Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、 Ponceau-3R StainSolution、Amido Black 10B) |
◆Western blotting推薦產品
● 封閉用脫脂奶粉 ● 高效轉膜液 ● 預染蛋白Marker ● 抗原抗體反應加速試劑 Immuno-enhancer ● WB專用膜 ● 過氧化物酶發光底物 |
參考文獻
● Rasheed Sule. et al. : Future Science., 75, 99 (2023)
● Habeebunnisa Begum. et al. : Future Science., 73, 58 (2022)
● 岡田雅人, 三木裕明, 宮崎香:「無·敵のバイオテクにカルシリーズ 改訂第4版 タンパク質実験ノート 下」p.44 (羊土社)
● 西方敬人:「バイオ実験イラストレイテッド⑤」p.165 (秀潤社)