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Phos-tag™ SDS-PAGE凝膠制膠方法1——樣品處理

播放:1006          上傳時間:2019-08-06

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Phos-tag™ Acrylamide新品速遞圖wako.jpg

SDS-PAGE分離不同磷酸化水平的蛋白!

 

  在不使用放射性同位素的情況下,利用Phos-tag™ SDS-PAGE即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于Western blotting和質(zhì)譜分析等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

  Phos-tag™ SDS-PAGE操作簡單,只需在常規(guī)SDS-PAGE膠中加入Phos-tag™ Acrylamide 和Mn2+或者Zn2+即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在電泳過程中,磷酸化蛋白的磷酸基團(tuán)與Phos-tag™中的二價金屬離子相結(jié)合,降低其遷移速度,從而可區(qū)分磷酸化與非磷酸化蛋白。

 

原理

phos-tag原理

優(yōu)點(diǎn)、特色

●  采用Phos-tag™ SDS-PAGE可輕松分離磷酸化蛋白

   無任何放射性元素及化學(xué)標(biāo)記!

  可檢測不同磷酸化水平的磷酸化蛋白

   無需任何磷酸化抗體!

  適用于內(nèi)源性蛋白的磷酸化分析!

 

案例、應(yīng)用

 

 

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】

 

我推薦使用Phos-tag ™ ——東京大學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究科 小川覺之

 

  Phos-tag ™ 是專為研究磷酸化蛋白而新開發(fā)出來的試劑。此產(chǎn)品使用方便,不但可用于體外實(shí)驗(yàn),還能定量分析體內(nèi)蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常規(guī)電泳實(shí)驗(yàn),無需購買特殊設(shè)備,性價比高。傳統(tǒng)蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體、RI 等其它試劑,操作復(fù)雜,花費(fèi)大,且放射性元素會有安全隱患,而Phos-tag ™ 的出現(xiàn)恰恰可以彌補(bǔ)這些缺點(diǎn),為磷酸化蛋白研究提供新的方向。

 

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分離效果圖

 

03.jpg

 

  Lane 1 為非磷酸化蛋白,Lane 2-5 為磷酸化蛋白,各蛋白因磷酸化狀態(tài)不同而條帶遷移率也有所不同。

  磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數(shù)量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的豐度等都可根據(jù)條帶遷移和條帶濃度求得。

 

【資料提供】

日本東京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)系研究科

 

【二維電泳中的應(yīng)用:分析hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體】

 

  小鼠巨噬細(xì)胞J774.1 經(jīng)LPS 刺激后,裂解細(xì)胞,經(jīng)過免疫沉淀法分離得到hnRNP K。在二維電泳中,一維是IPG 膠,二維是Phos-tag ™ SDS-PAGE,可分離hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀,可以確認(rèn)不同的點(diǎn)代表不同的亞型或修飾蛋白。

 

二維電泳

 

04.jpg

 

  同一個等電點(diǎn)的位置上,不同位點(diǎn)發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)

 

【參考文獻(xiàn)】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

 

【結(jié)果提供】

  橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)理化學(xué)研究所RCAI 小原收

 

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】

 

  常規(guī)SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實(shí)驗(yàn)分析EGF 刺激的A431 細(xì)胞中MAPK 磷酸化水平。

blob.png

  摘自Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

 

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱規(guī)格包裝
304-93526

Phos-tag Acrylamide AAL-107

5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液

蛋白研究0.3 mL
300-93523

Phos-tag Acrylamide AAL-107

Phos-tag 丙烯酰胺

蛋白研究2 mg
304-93521

Phos-tag Acrylamide AAL-107

Phos-tag 丙烯酰胺

蛋白研究10 mg
134-15302Manganese(II) Chloride Tetrahydrate氯化錳四水合物for Molecular Biology25 g

 

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