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廣州同譜實驗儀器有限公司
主營產品： kromasil色譜柱,通用石墨管,SPE固相萃取小柱 |
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2021-3-16 閱讀(2451)
應用簡介
本實驗重現了《食品中丙烯酰胺的測定》GB 5009.204-2014中首一法——穩定性同位素稀釋的液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS），樣品經超純水提取，先后經Cleanert® PEP和Cleanert® SAS固相萃取柱凈化，Venusil® MP C18色譜柱（2.1 × 150 mm，5 μm，100 Å）分離，0.1%的甲酸水溶液作為流動相洗脫，三重四級桿質譜檢測，內標法進行定量。結果表明：當丙烯酰胺的加標量為2 mg/kg時，回收率在100% ~ 115%，可以滿足檢測要求。
丙烯酰胺（acylamide；CAS登記號79-06-1）是一種無色、無臭透明片狀晶體；可溶于水、醇、丙酮、醚和三氯甲烷，微溶于甲苯，不溶于苯和庚烷。相對分子質量為71.08，結構式如圖1所示。丙烯酰胺是一種*的神經毒素和準致癌物，動物實驗和體外細胞實驗都證明丙烯酰胺還可導致遺傳物質發生改變，早在2005年癌癥研究機構就已將其列為2*致癌物質。2002年4月，瑞典國家食品管理局發現許多含淀粉的食物經過煎、烤、炸等高溫烹調后會產生高含量的丙烯酰胺。眾多研究表明薯條、薯片等土豆制品中丙烯酰胺的含量非常高，超過飲用水中允許大限度的500多倍。
因此通過有效的實驗技術手段，對食品中的丙烯酰胺進行監控，以確保消費者對食品消費的安全具有重要意義。
本實驗通過優化前處理方法建立了丙烯酰胺在食品中的LC-MS/MS方法。
實驗部分
儀器、試劑與材料
主要儀器設備
AB SCIEX API 4000+液相質譜聯用儀；
試劑材料
某品牌原味薯片、油條；甲酸、甲醇、正己烷皆為色譜純；屈臣氏水；丙烯酰胺標準品（純度 > 99%），用水溶；
D3-丙烯酰胺標準溶液（CD2=CDCONH2）（濃度500 mg/L，溶劑乙腈）;80%甲醇水溶液：取20 mL水，加甲醇稀釋定容至100 mL；
0.1%甲酸溶液：移取100 μL甲酸并加入100 mL水，搖勻；一次性無菌注射器；尼龍針式過濾器(0.22 μm，直徑13 mm)；
Cleanert® PEP固相萃取柱：200 mg/6 mL；Cleanert® SAS固相萃取柱：200 mg/3 mL。
樣品制備
樣品提取
準確稱取粉碎后的1 g樣品置于50 mL離心管中，加入200 μL D3-丙烯酰胺內標（1 mg/L），再加入10 mL水，超聲振蕩30 min后，于8000 r/min離心5 min，將上清液轉移到15 mL離心管中，加入5 mL正己烷，漩渦萃取1 min，以6000 r/min的速度離心5 min，除去上層有機相，再用5 mL正己烷重復萃取一次，之后迅速取5 mL水相作為上樣液。
樣品凈化
Cleanert® PEP固相萃取柱（200 mg/6 mL）使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，將上述上樣液上Cleanert® PEP固相萃取柱，收集上樣液，并用4 mL 80%的甲醇水溶液洗脫，合并收集全部洗脫液，該洗脫液待用Cleanert®SAS固相萃取柱凈化；Cleanert®SAS固相萃取柱（200 mg/3 mL）依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，將上述洗脫液全部上樣，在重力作用下流出，收集全部流出液，并用2 mL甲醇洗脫，合并收集全部洗脫液。于40℃下氮吹濃縮至近干，用水定容至1 mL，待LC-MS/MS檢測。
注：上述操作步驟可在Qdaura®卓睿全自動固相萃取儀上完成。
色譜條件
液相條件
色譜柱：Venusil® MP C18，5 μm，100 Å，2.1 × 150 mm；
流動相： 0.1%甲酸水溶液；
柱 溫：26℃；
流 速：0.2 mL/min；
進樣量：2 μL。
質譜條件
離子源：ESI+；電噴霧電壓：5500 V；霧化氣壓力：45 psi；氣簾氣壓力：10 psi；輔助氣壓力：45 psi；離子源溫度：330℃；采集方式：多反應監測(MRM)。
表1. 丙烯酰胺質譜參數
物質名稱 | Q1 | Q3 | CE/V |
丙烯酰胺 | 72 | 55 | 15 |
44 | 15 | ||
D3-丙烯酰胺 | 75 | 58 | 16 |
44 | 25 |
結果與討論
線性關系
分別配制濃度為0.01 mg/L、0.05 mg/ L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、3 mg/L的丙烯酰胺標準溶液（內標：0.1 mg/L），進行液相色譜-質譜/質譜檢測，以各標準溶液的丙烯酰胺進樣濃度（mg/L）為橫坐標，以丙烯酰胺的峰面積與內標D3-丙烯酰胺的峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖2所示，擬合參數如表2。
表2. 丙烯酰胺標準曲線和檢出限
化合物名稱 | 標準曲線方程 | 相關系數 | 檢出限(mg/L，S/N = 3) |
丙烯酰胺 | Y=9.41X + 0.0706 | 0.9999 | 0.005 |
實驗結果
由表3可知，采用固相萃取結合液相色譜-質譜/質譜法檢測丙烯酰胺，內標法定量，丙烯酰胺的加標回收率在100% ~ 115%之間，滿足檢測要求。
表3.丙烯酰胺加標回收實驗結果(n=3)
物質名稱 | 添加水平 | 出峰時間 | 平均回收率（%） | RSD（%） | ||
薯片 | 油條 | 薯片 | 油條 | |||
丙烯酰胺 | 2 mg/kg | 3.56 | 108.6 | 113.6 | 3.33 | 2.77 |
結論
本實驗依據《食品中丙烯酰胺的測定》GB 5009.204-2014中首一法——穩定性同位素稀釋的液相色譜-質譜/質譜法建立了食品中丙烯酰胺的檢測方法，并用內標法結合LC-MS/MS對食品中丙烯酰胺含量進行了測定。當加標量為2.0 mg/kg時，回收率在100% ~ 115%之間，符合要求。
附：相關產品
產品名稱 | 規格描述 | 包裝數量 | 訂貨號 |
Venusil® MP C18 | 5μm,100Å, 2.1×150 mm | 1支 | VA951502-0 |
Cleanert® PEP | 200mg/6mL | 30支 | PE2006 |
Cleanert®SAS | 200mg/3mL | 50支 | SS2003 |
Qdaura®卓睿全自動固相萃取儀 | 24位，四通道 | 1臺 | SPE-40 |
氮吹儀 | 15位 | 1臺 | NV15-M |
1.5 mL樣品瓶 | 短螺紋透明帶書寫處 32×11.6mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 mL樣品瓶蓋 | 9mm中心孔藍蓋，紅色橡膠/米色PTFE隔墊 45°Shore A; 1.0mm | 100/pk | 0915-1819 |
針式過濾器(Nylon) | 單膜，13mm，0.22µm | 200個/包 | AS021320 |
一次性注射器 | 2 mL無針頭 | 100支/包 | LZSQ-2ML |
甲醇 | 4L/瓶，色譜純 | 4×4L/箱 | AH230-4 |
正己烷 | 4L/瓶，HPLC級 | 4×4L/箱 | AH216-4 |
