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慢病毒常被用作基因傳遞和基因編輯工具，在基因治療、基因表達調(diào)控、疾病模型構(gòu)建等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用

主要特點

1. 穩(wěn)定的基因傳遞和表達: 慢病毒載體能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定地整合到宿主細胞基因組中，并且在細胞分裂過程中傳遞給后代細胞。這種整合性基因傳遞方式確保了外源基因在宿主細胞中的長期穩(wěn)定表達。

2. 可控的基因表達水平: 通過調(diào)整慢病毒載體的構(gòu)建和設(shè)計，可以實現(xiàn)對外源基因表達水平的調(diào)控。例如，可以利用不同的啟動子、增強子和調(diào)節(jié)元件來控制基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的表達量調(diào)節(jié)。

3. 多功能性應(yīng)用: 慢病毒載體不僅可以用于基因傳遞和基因表達調(diào)控，還可以用于基因編輯、基因治療、細胞工程等多種應(yīng)用，如CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯、CAR-T細胞治療等。通過慢病毒載體的介導(dǎo)，可以將基因編輯工具或特定基因序列導(dǎo)入目標(biāo)細胞中，實現(xiàn)對基因的精準(zhǔn)編輯和調(diào)控，從而改變細胞的功能和特性，實現(xiàn)基因修復(fù)、突變或敲除等功能。

讓我們來看看如何利用慢病毒載體多面操縱基因調(diào)控

一、慢病毒載體介導(dǎo)編碼基因過表達及點突變

★文章標(biāo)題：Gain-of-function mutations in the catalytic domain of DOT1L promote lung cancer malignant phenotypes via the MAPK/ERK signaling pathway

★發(fā)表期刊：Science Advances

★作者單位：沈陽藥科大學(xué)

本文中，作者鑒定了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L中的一系列功能獲得性突變。其中強的是位于催化DOT結(jié)構(gòu)域R231Q，R231Q可以增強DOT1L的底物結(jié)合能力。此外，R231Q 在體外和體內(nèi)促進肺癌細胞的細胞生長和耐藥性。機制研究還表明，R231Q突變體通過富集RAF1啟動子上的H3K79me2和表觀遺傳調(diào)控下游靶標(biāo)的表達來特異性激活MAPK/ERK信號通路。DOT1L抑制劑（SGC0946）和MAPK/ERK軸抑制劑（binimetinib）的聯(lián)合運用可以有效逆轉(zhuǎn)R231Q誘導(dǎo)的表型。以上研究結(jié)果揭示了表觀遺傳酶的功能獲得性突變，并為肺癌患者的精準(zhǔn)治療提供了有希望的見解。

圖1. 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L的R231Q位點突變可以增強DOT1L的底物結(jié)合能力，促進腫瘤生長

二、慢病毒載體介導(dǎo)非編碼基因circRNA過表達

★文章標(biāo)題：CircCRIM1 suppresses osteosarcoma progression via sponging miR146a-5p and targeting NUMB

★發(fā)表期刊：American Journal Of Cancer Research

★作者單位：江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院

CircCRIM1是一種環(huán)狀RNA，通過反向剪接基因CRIM1形成。最近的研究表明，CircCRIM1在包括骨肉瘤（OS）在內(nèi)的多種惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生中具有多種功能。本文作者研究了circCRIM1在OS進展中的作用和機制。通過檢索GSE96964的circRNA表達微陣列數(shù)據(jù)集，篩選OS和人成骨細胞（hFOB1.19）中差異表達的circRNA（包括circCRIM1）。RT-qPCR檢測circCRIM1及其海綿miRNA和靶基因的表達水平。通過體外功能獲得實驗研究了circCRIM1對OS細胞增殖、遷移和侵襲的影響。通過測量裸鼠皮下和原位腫瘤生長來評估 circCRIM1對OS的體內(nèi)功能。circCRIM1的過表達抑制了OS細胞在體外的遷移、侵襲、增殖和體內(nèi)OS腫瘤的生長。在機制上，作者通過生物信息學(xué)預(yù)測將miR146a-5p鑒定為circCRIM1的海綿miRNA，并通過報告基因檢測和FISH分析證實了它們的相互作用和共定位。這種相互作用導(dǎo)致下游靶基因NUMB的表達增加，這將導(dǎo)致Notch信號通路的抑制。作者進一步證明了miR146a-5p過表達可以逆轉(zhuǎn)OS細胞中circCRIM1誘導(dǎo)的抗腫瘤作用。以上研究結(jié)果支持circCRIM1通過海綿化miR146a-5p及其下游靶標(biāo)NUMB在OS中充當(dāng)腫瘤抑制因子。

圖2. circCRIM1的過表達抑制了骨肉瘤細胞在體外的遷移、侵襲、增殖和體內(nèi)骨肉瘤瘤的生長

三、慢病毒載體介導(dǎo)非編碼基因LncRNA干擾

★文章標(biāo)題：Long noncoding RNA AGPG regulates PFKFB3-mediated tumor glycolytic reprogramming

★發(fā)表期刊：Nature communications

★作者單位：中山大學(xué)

腫瘤細胞通常會重新編程其新陳代謝以實現(xiàn)快速增殖。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在代謝重塑中的作用及其潛在機制仍然難以捉摸。通過篩選，作者發(fā)現(xiàn)lncRNA AGPG是食管鱗狀細胞癌（ESCC）中糖酵解活性增加和細胞增殖所必需的。在機制上，AGPG結(jié)合并穩(wěn)定 6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3），通過阻止APC/C介導(dǎo)的泛素化，AGPG 保護PFKFB3免受蛋白酶體降解，導(dǎo)致PFKFB3在癌細胞中積累，隨后激活糖酵解通量并促進細胞周期進程。AGPG也是p53的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo);TP53的缺失或突變會觸發(fā)AGPG的顯著上調(diào)。值得注意的是，抑制AGPG會顯著損害患者來源的異種移植物（PDX）模型中的腫瘤生長。臨床上，AGPG在許多癌癥中高表達，AGPG高表達水平與預(yù)后不良相關(guān)，提示AGPG是一種潛在的生物標(biāo)志物和癌癥治療靶點。

圖3. 敲低AGPG抑制腫瘤形成抑制增殖和下游基因表達

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圖4. 和元生物VPack系統(tǒng)LncRNA表達及感染效果圖

四、CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)基因敲除

★文章標(biāo)題：A novel protein RASON encoded by a lncRNA controls  oncogenic RAS signaling in KRAS mutant cancers

★發(fā)表期刊：Cell Research

★作者單位：南京大學(xué)

作者報道了RASON是一種由LINC00673編碼的新型蛋白質(zhì)，是致癌RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)因子。RASON在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）患者中異常過表達，在體外促進人PDAC細胞系的增殖和體內(nèi)腫瘤生長。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細胞中Rason的敲除抑制KRAS介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化。Rason的基因缺失消除了LSL-KrasG12D Trp53R172H/+型小鼠中致癌基因KRAS驅(qū)動的胰腺癌和肺癌發(fā)生。從機制上講，RASON直接與KRASG12D/V結(jié)合并抑制內(nèi)源的和GTP酶激活蛋白（GAP）介導(dǎo)的GTP水解，從而維持KRASG12D/V處于 GTP結(jié)合的活躍狀態(tài)。在治療上，敲除 RASON會使KRAS突變的胰腺癌細胞和患者來源的類器官對EGFR抑制劑敏感。以上研究結(jié)果表明，RASON是致癌基因KRAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是一個KRAS突變癌癥的有前途的治療靶點。

圖5. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細胞中Rason的敲除抑制KRAS介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化

五、CRISPRa技術(shù)實現(xiàn)內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄激活

除了可以基因敲除外，CRISPR技術(shù)也可以對內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄進行激活。利用CRISPR/Cas9技術(shù)進行基因的敲除、插入、替換依賴的是Cas9蛋白切割DNA的能力，而如果人為突變RuvC1、HNH兩個剪切位點，Cas9蛋白的切割能力損失成為dCas9蛋白，但仍可以與gRNA結(jié)合形成復(fù)合物。dCas9和gRNA復(fù)合物可以結(jié)合在DNA的特定位置上，在此基礎(chǔ)上，研究人員在復(fù)合物的后方連接一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如轉(zhuǎn)錄激活的VP64、VP16元件等，同時將復(fù)合物錨定在基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的上游，即可實現(xiàn)對特定基因的轉(zhuǎn)錄激活。

圖6. SAM技術(shù)實現(xiàn)內(nèi)源性基因激活

Chavez A,et al,.Nat Methods,2016

圖7. 加入gRNA后mCherry表達明顯增強

總的來說，慢病毒載體在基因調(diào)控中具有穩(wěn)定的基因傳遞和表達能力，可實現(xiàn)對外源基因的可控和特異性表達，為基因研究、基因治療和細胞工程等領(lǐng)域提供了強大的工具和平臺。

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