目錄:和元李記(上海)生物技術(shù)有限公司>>細胞生物學>>支原體檢測與祛除>> AC16L064Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100 T |
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貨號 | AC16L064 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品描述
Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒,本試劑盒采用一對支原體特異性引物,用于對樣品的支原體基因組DNA進行PCR擴增,然后通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。試劑盒內(nèi)同時含有內(nèi)參對照,用于監(jiān)控PCR是否正常擴增。
本試劑盒與MB Zell Shield 13-0050等產(chǎn)品相比更具優(yōu)勢,替代性強,具體情況可詳見下文或咨詢銷售人員。
本試劑盒是一種廣譜的支原體檢測試劑盒,可以識別所有100多種至今已發(fā)現(xiàn)的支原體;能用于檢測一切可能含支原體的樣品,比如:體外細胞培養(yǎng)的上清;血清;各種體液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;其他液體樣品等。具有100%支原體識別率、靈敏度*、含內(nèi)參條帶從而可以區(qū)分真陰性樣品和假陰性樣品、無需配套相對昂貴的熒光定量PCR儀等優(yōu)點。
經(jīng)多次測試,本試劑盒有記錄可以識別在體外細胞培養(yǎng)中曾經(jīng)報道出現(xiàn)的20種支原體,根據(jù)文獻報道,這些支原體基本能占污染細胞的支原體種類的100%。具體如下:(1)M. hyorhinis、(2)M. fermentans、(3)M. arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)A. laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M. bovis、(11)M. bovoculi、(12)A. axanthum、(13)M. buccale、(14)M. pneumoniae、(15)M. arthritidis、(16)M. pulmonis、(17)M. gallisepticum、(18)M. gallinarum、(19)M. canis、(20)Ureaplasma urealyticum(注:M.為Mycoplasma的縮寫; A.為Acholeplasma的縮寫)。
訂購信息
產(chǎn)品貨號 | 規(guī)格 | 試劑盒組分 | 價格 |
AC16L064 | 100 T | ①支原體引物和內(nèi)參(100次):206 μL;②陽性支原體DNA:50 μL;③去離子水:1.8 mL(請使用普通蒸餾水或去離子水,不能使用去內(nèi)毒素的水)。 | 1680 |
【注】:
以下試劑需要自行準備:①普通的Taq DNA 聚合酶(推薦使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version,貨號:RR006A,已包含2.5 mM 的 dNTP)和相應(yīng)的緩沖液;② 2.5 mM的dNTP;③DNA上樣緩沖液(推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X),貨號:AN34L047,該緩沖液已含無毒核酸染料,不需要接觸 EB 等致癌物質(zhì))。
運輸與保存條件
冰袋運輸,-20℃保存,可以保存五年。
使用方法
1.待測樣品的準備
取換液后培養(yǎng)2-3 d且匯合度在90%左右的細胞培養(yǎng)液上清(貼壁細胞)。懸浮培養(yǎng)的細胞在換液傳代后,生長2-3 d再取培養(yǎng)液進行檢測。可以按照以下兩種方法之一進行樣品的前處理:
方法一
(1)取 150μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nèi),在普通臺式離心機上1000 rpm 低速離心5 min;
(2)上述離心上清液,95 ℃加熱處理5 min(可以轉(zhuǎn)移到 PCR 管內(nèi),在 PCR 儀上進行加熱處理),簡單離心(1000g,5 s)后,取上清進行檢測。
方法二(推薦本方法,有高速離心機的的可選用本方法,可以去PCR抑制物,準確性更高。)
(1)根據(jù)濃縮倍數(shù),可以取100 - 1500μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nèi),普通臺式離心機1000 rpm 離心5 min,將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管內(nèi),丟棄細胞沉淀。
(2)將上清繼續(xù)13000 rpm(約16000 g)高速離心5 min,小心吸走全部上清,用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5(推薦使用,樣品可以長期保存)或者去離子水(樣品比較不穩(wěn)定,只適合當天或短期內(nèi)檢測使用)重懸、沉淀(沉淀中含有支原體),吹吸均勻。
(3)該重懸后的樣品可以直接檢測,也可以進行熱處理后再檢測(熱處理后,樣品保存更穩(wěn)定)。熱處理具體如下:95 ℃加熱處理 5 min(可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi),在PCR儀上進行加熱處理),簡單離心(1000g,5 s)后,取上清進行檢測。
【注】:
① 這里的細胞培養(yǎng)上清不是指細胞經(jīng)*酶消化后的離心上清,而是指至少培養(yǎng) 2 d后的貼壁細胞培養(yǎng)液上清或懸浮細胞培養(yǎng)液;
② 本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細胞,以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g,該離心力下,哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會;
③ 收集的待測細胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測,請放于-20℃或-80℃冰箱保存;
④ 如果預期待測樣品支原體含量較少(比如低溫保存的血清、臍帶血、*mei、抗生素、未使用的培養(yǎng)液、生物制品、極個別細胞培養(yǎng)上清等),可以采取措施以提高檢測的靈敏度,具體方法請看后文注意事項部分:如何提高本試劑盒檢測靈敏度。
2.PCR 體系的配制
(1)按照25μL體系配制比例如下。如果是多樣品檢測,加兩個對照樣品后各組分總體積如下表。配制好的混合液,按每管23μL分裝到0.2 mL的PCR管中。
單個樣品體積(μL) | 樣品總數(shù) | 總體積(μL) | |
去離子水 | 16.375 | N | 16.375×(N+2)×1.06 |
Takara 10× Ex Taq buffer(含 Mg2+) | 2.5 | N | 2.5×(N+2)×1.06 |
2.5 mM dNTP | 2 | N | 2×(N+2).06 |
Takara 5 Units/μL Ex Taq Hot Start | 0.125 | N | 0.125×(N+2)×1.06 |
支原體引物和內(nèi)參 | 2 | N | 2×(N+2)×1.06 |
【注】:
① 總體積中多配制 6% 是為了防止移液導致誤差,以保證每個反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量;
② 如果有條件,PCR 體系的配制建議在冰上進行操作;
③ 本試劑盒不推薦使用 2× 的 PCR mixture(內(nèi)含 Taq 酶、緩沖液和 dNTP),建議使用Taq酶、10×Taq 緩沖液和 dNTP 等試劑配制PCR體系;
④ 為了避免可能的污染,收到的支原體引物和內(nèi)參,可以適當分裝(比如:每支 40μL)后冷凍保存;
⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶(前提是:陰性對照的 586 bp 內(nèi)參條帶必須有一定亮度,且穩(wěn)定性良好,否則不能使用),酶、去離子水的加入量需要根據(jù)其說明書進行調(diào)整。
(2)加入待測樣品、陰性和陽性對照樣品。樣品檢測管中加入2μL待測樣品,陰性對照管加入2μL去離子水,陽性對照管加入2μL陽性支原體 DNA。
【注】:
① 裝有陽性支原體 DNA 的螺口管開蓋之前,低速離心或用手指捏住,用力甩一下即可;
② 進行反應(yīng)體系配制的房間,與樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間建議分開。
3.PCR 參數(shù)設(shè)置
1 cycle | 94 ℃ | 2 min |
40 cycles | 94 ℃ | 15 sec |
55 ℃ | 15 sec | |
72 ℃ | 45 sec | |
1 cycle | 72 ℃ | 5 min |
1 cycle | 8 ℃ | forever |
4.PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
配制含溴化乙錠(EB)的濃度為 1.5%的 DNA 瓊脂糖凝膠(推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X),貨號:AN34L047,該產(chǎn)品預添加了無毒安全染料);當溴酚藍染料跑出上樣孔 3-4 cm時,停止電泳,拍照。
5.結(jié)果判斷
PCR 擴增的結(jié)果有可能出現(xiàn)以下幾種情況:
電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | DNA Mark | |
586 bp 內(nèi)參條帶 | ++ | - | + | ++ | ++ | - | |
270 bp 左右條帶 | - | ++++ | +++ | ++ | + | - | |
結(jié)果圖示(見圖1) | 泳道 1 | 泳道 2 | 泳道 3 | 泳道 4 | 泳道 5 | 泳道 6 | 泳道M |
支原體污染判斷 | 陰性 | 極重度污染 | 重度污染 | 中度污染 | 輕度污染 | PCR被抑制 |