文 獻 精 讀
再帕爾 · 阿不力孜科研團隊 第33期
中國醫學科學院藥物研究所
天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室
文獻整理：尕曼 指導教師：賀玖明
本課題組在《PNAS》上發表了一篇題為“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的研究論文，采用AFADESI-MSI技術，建立了空間分辨的原位代謝組學方法，并提出一種“下游代謝物與上游代謝酶關聯” 的研究策略來表征腫瘤代謝改變；結合免疫組化分析驗證，從代謝物和代謝酶兩個層次和組織原位深入探究食管癌的代謝改變，發現并可視化表征了食管癌異常的代謝通路及其代謝酶。*的代謝模式是腫瘤細胞區別于正常細胞的重要特征，越來越多的研究表明，在腫瘤的發生、發展過程中，腫瘤細胞會發生特定譜式的代謝改變以適應腫瘤生長。對于不同組織來源的腫瘤細胞，盡管彼此間的基因變異譜千差萬別，但是，幾乎所有的腫瘤都需要通過類似的代謝重編程（Metabolic Reprogramming）來維持其無限制的細胞增殖。腫瘤代謝的表征能夠為癌癥病理機制研究、腫瘤診療新指標和干預靶點的發現提供新的契機。然而，到目前為止，如何全面的發現腫瘤的異常代謝，尤其是如何從代謝物和代謝酶兩個層面上原位地表征腫瘤的異常代謝仍然面臨非常大的困難。收集256例人鱗片狀食管癌（ESCC）組織標本，包括癌組織、癌旁組織和遠端非癌組織，制成冰凍組織切片。如圖1所示，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化質譜成像技術（AFADESI-MSI），采集上述組織中內源性代謝物及其空間分布信息；對相鄰切片進行HE染色；采用MassImager質譜成像數據處理軟件，使質譜成像圖與HE染色圖匹配重合，按不同組織類型及空間分布提取代謝物輪廓信息；使用SIMCA軟件進行多變量統計分析，篩選出與腫瘤代謝相關的差異代謝物；根據差異代謝物及其鑒定結果富集分析發生變化的代謝通路及推測關鍵代謝酶；采用免疫組化方法檢測鎖定的代謝酶表達，進一步驗證其與代謝標志物是否具有同樣的空間分布特征。圖1 采用空間分辨的原位代謝組學研究策略，發現腫瘤代謝變化
1 脯氨酸生物合成上調
脯氨酸作為細胞微環境中的重要氨基酸參與細胞凋亡和自噬，在癌癥代謝中的重要作用得到越來越多的關注。根據256個食管癌組織樣本的統計數據，癌區脯氨酸離子強度顯著高于上皮和肌肉區(P<0.001，圖2C)。采用免疫組化方法檢測與脯氨酸合成相關的關鍵代謝酶吡咯-5-羧酸還原酶2（PYCR2）在ESCC組織切片中的空間表達，發現PYCR2只在癌區表達(圖2e)，與食管癌組織中脯氨酸的空間分布一致。圖2 脯氨酸生物合成途徑中關鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A）脯氨酸的質譜成像（B）光學-MSI重疊圖像（C）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中脯氨酸水平 ***p<0.001（D）ESCC組織的HE染色圖 （E）不同ESCC組織中PYCR2的表達 CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
2 尿苷代謝上調
尿苷是RNA合成的重要核苷前體，也參與嘌呤核苷酸生物合成和碳水化合物代謝。此外，組織中尿苷的水平對于嘧啶類抗代謝藥物的抗腫瘤治療至關重要。研究發現癌組織中尿苷含量高于上皮組織而低于肌肉組織（P<0.001,圖3 A1和A3），而尿嘧啶的含量在癌組織中顯著升高（P<0.001,圖3 A2和A4），尿嘧啶/尿苷離子強度比（圖3A6）在癌區顯著增加，可以作為區分癌組織與癌旁正常組織的生物標志物。同樣，免疫組化結果顯示催化尿嘧啶生成尿苷的代謝酶尿苷磷酸化酶1(UPase 1)在癌組織中的表達上調。圖3A 尿苷代謝途徑中關鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A1，A2）尿苷和尿嘧啶的質譜成像圖 （A3，A4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶水平 ***p<0.001（A5）UPase 1介導的尿苷轉換為尿嘧啶的代謝過程（A6）根據尿嘧啶/尿苷離子強度比值構建的質譜成像圖 （A7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶的強度變化（A8）ESCC不同區域UPase 1的表達 CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
3 組胺代謝下調
組氨酸在組氨酸脫羧酶(HDC)的介導下代謝為組胺。有越來越多的證據顯示組胺直接參與致癌作用，可以作為一種潛在的細胞保護劑來改善癌癥治療。根據一些研究者的說法，基于組胺的治療能促進癌細胞中DNA損傷、凋亡和衰老并可以顯著增加患癌動物的存活率。在本研究中，組氨酸和組胺呈現*相反的空間分布。根據256例食管癌組織樣本的成像數據，組氨酸在癌組織中顯著上調而組胺顯著下調。組胺與組氨酸的離子強度差異如圖3B7所示。通過計算組胺與組氨酸的離子強度比，對HDC介導的組氨酸脫羧反應進行了研究(3B6)，發現腫瘤組織的脫羧率相對于肌肉和上皮組織較弱。和基于強度比的質譜成像預測的一致，腫瘤組織的HDC表達水平低于肌肉組織和上皮組織。圖3B 組胺代謝途徑中關鍵代謝物和代謝酶的原位分析 （B1，B2）組氨酸和組胺質譜成像圖（B3，B4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺水平 （B5）HDC介導的組氨酸轉換為組胺的代謝過程（B6）根據組胺/組氨酸離子強度比值構建的質譜成像圖（B7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺的離子強度變化（B8）ESCC不同區域HDC的表達
此外，發生改變的代謝途徑還有谷氨酸代謝，脂肪酸合成以及多胺的生物合成，均在腫瘤組織中表現為顯著增多，相應的免疫組化結果也證明與上述途徑有關的關鍵代謝酶在癌區的表達也明顯上調。以下（表1）為通過256例食管癌患者組織樣本篩選出的發生改變的6條代謝途徑和相應的關鍵代謝酶：該研究建立了一種高靈敏的空間分辨的原位代謝組學方法，對食管癌潛在原位標志物進行了代謝通路分析，并對通路上相關聯代謝物的分布特征進行原位可視化表征，分析其空間變化趨勢，發現了并驗證了6個在食管癌中異常表達的代謝酶：吡咯-5-羧酸還原酶2(PYCR2)、谷氨酰胺酶(GLS)、尿苷磷酸化酶1(UPase1)、組氨酸脫羧酶(HDC)、脂肪酸合成酶(FASN)和鳥氨酸脫羧酶(ODC)，它們廣泛參與食管癌相關的腫瘤代謝過程，其中PYCR2和UPase1被*發現在食管癌中異常改變。研究結果表明脯氨酸生物合成，谷氨酸代謝，尿苷代謝，組氨酸代謝，脂肪酸合成，多胺生物合成等代謝通路在食管癌組織中發生了顯著變化。這些癌癥代謝相關信息有助于增加對癌癥代謝重編程的理解。基于AFADESI-MSI技術的空間分辨原位代謝組學方法，不僅可驗證腫瘤原位標志物的可靠性；同時針對腫瘤等具有復雜結構的組織，它具有原位、無需特殊標記、無需復雜耗時的前處理及反復染色過程，能夠高通量地發現腫瘤異常變化的代謝通路及其代謝酶等優勢；可從代謝物和代謝酶兩個層次全面表征腫瘤的代謝改變并發現其潛在功能，為深入探究腫瘤的代謝改變提供了全新的研究視角。Sun, C., et al. (2019). "Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations." Proceedings of the National Academy of Sciences 116(1): 52-57.
