中央民族大學(xué)再帕爾·阿不力孜教授團(tuán)隊(duì)在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上發(fā)表了一篇題為“In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging”的研究論文，建立了一種基于空氣動(dòng)力輔助離子化質(zhì)譜成像技術(shù)（AFADESI-MSI）的原位代謝組學(xué)方法，用于研究馬兜鈴酸（AAs）引起的腎毒性，發(fā)現(xiàn)了與腎毒性有關(guān)的代謝產(chǎn)物并證明了該方法用于研究藥物毒性分子機(jī)制的可能性。

AAs具有抗病毒、抗菌和抗腫瘤等活性，但同時(shí)也具有腎毒性，目前與AAs相關(guān)的腎損傷和功能障礙的潛在機(jī)制仍不*清楚。之前已開發(fā)了基于LC-MS、GC-MS的代謝組學(xué)方法來研究AAs的腎毒性，但對(duì)它們在腎臟內(nèi)的空間分布了解甚少。本論文采用基于AFADESI-MSI的原位代謝組學(xué)方法，將AFADESI與超高分辨率Q-OT-qIT質(zhì)譜儀結(jié)合用于研究AAs引起的腎毒性作用，揭示AAs誘導(dǎo)的腎毒性背后的復(fù)雜病理過程。

1.樣品制備和生化分析

將大鼠隨機(jī)分為AAs致腎毒性組（n=6）和對(duì)照組（n=6），分別收集24h尿液樣品和血液樣品（血液樣品經(jīng)離心后獲得血清）進(jìn)行生化分析。隨后將大鼠處死速凍后，將腎臟切成10 μm的切片，并用H＆E染色以顯示組織病理學(xué)病變。

2.AFADESI-MSI分析和數(shù)據(jù)處理

采用AFADESI分析大鼠腎臟切片，以200 μm/s的恒定速率在x方向上連續(xù)掃描組織表面，并在y方向上間隔200 μm在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，掃描范圍為m/z 100-1000，隨后使用Xcalibur軟件獲取數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassImager中進(jìn)行離子圖像重建，再采用Markerview™、SIMCA-P進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析（圖1）。

圖1

1.AFADESI-MSI條件的優(yōu)化

通過分析同一大鼠腎臟的相鄰組織切片，研究質(zhì)量分辨率對(duì)選擇性、靈敏度和空間分辨率的影響。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)分辨率從30000提高至240000時(shí)，可有效分離相差僅0.02 Da的信號(hào)，從而改善圖像的選擇性。但掃描速度隨分辨率的提高而降低，這可能會(huì)影響分析的靈敏度和空間分辨率。終選擇分辨率為120000，以在選擇性、靈敏度和空間分辨率之間取得良好的平衡。

圖2.大鼠腎臟中m/z接近的代謝物圖像

通過連續(xù)3天分析相鄰腎臟切片評(píng)估AFADESI-MSI方法的重現(xiàn)性。將9種代表性代謝物進(jìn)行提取和比較，并計(jì)算皮質(zhì)、外延髓和內(nèi)延髓中這些代謝物相對(duì)強(qiáng)度的RSD以評(píng)估日內(nèi)精密度。其中甜菜堿、甘油磷酸膽堿和PE（36：4）的重現(xiàn)性如圖3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分代謝物相對(duì)強(qiáng)度的RSD＜20％，這表明AFADESI-MSI可以可重現(xiàn)地提供半定量數(shù)據(jù)。

圖3. AFADESI-MSI方法的重現(xiàn)性

2.AAI治療大鼠的腎損傷評(píng)估

表1為體重和生化參數(shù)。結(jié)果表明，AAI治療大鼠的體重下降，尿蛋白（Upr）、尿蛋白-肌酐比（Upr/Ucr）和肌酐（Ucr）增加，這表明AAI引起了大鼠的腎毒性作用。此外在AAI治療組中血清甘油三酸酯增加，但兩組之間的血清膽固醇酯、血清HDL和血清LDL無明顯差異。

表1

圖4為腎臟組織的H＆E染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AAI治療大鼠出現(xiàn)腫脹和形態(tài)變化，且皮質(zhì)和延髓均出現(xiàn)壞死和炎性細(xì)胞浸潤。這些病理變化進(jìn)一步表明AAI能引起大鼠快速進(jìn)展性腎小管間質(zhì)病變。

圖4.（A）對(duì)照和（B）AAI治療大鼠腎臟切片的H＆E染色結(jié)果

3.AFADESI-MSI分析

采用AFADESI-MSI在正離子模式下檢測對(duì)照組和AAI治療組的大鼠腎臟切片以研究AAI對(duì)大鼠腎臟的生物學(xué)效應(yīng)。在腎皮質(zhì)、外延髓和內(nèi)延髓分別檢測到512、368和388個(gè)生物學(xué)信息峰。圖5為腎皮質(zhì)、外延髓和內(nèi)延髓的OPLS-DA散點(diǎn)圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFADESI-MSI可將對(duì)照組的三個(gè)區(qū)域清楚分開，但AAI治療組中的三個(gè)區(qū)域之間分離趨勢不明顯，可能是由于AAI對(duì)腎臟不同形態(tài)區(qū)域的代謝物具有組織特異性作用。

圖5.對(duì)照組（A）和AAI治療組（B）的OPLS-DA得分圖

隨后進(jìn)行了一系列OPLS-DA分析，以進(jìn)一步研究AAI對(duì)腎皮質(zhì)、外延髓和內(nèi)延髓的影響。結(jié)果如圖6所示，AAI治療后腎皮質(zhì)的代謝組學(xué)改變比外延髓和內(nèi)延髓的改變更明顯，這表明腎皮質(zhì)比延髓更易受AAI影響。基于預(yù)測閾值>1.0和P<0.05的變量重要性，分別選擇了85、65和51個(gè)變量作為AAI誘導(dǎo)的腎皮質(zhì)、外延髓和內(nèi)延髓毒性的潛在生物標(biāo)志物，然后通過MS/MS初步鑒定出38個(gè)差異代謝物（表2）。為進(jìn)一步評(píng)估這些代謝物與AAI引起的腎毒性的關(guān)系，提取了這些代謝物的離子圖像，并與相鄰切片H＆E染色獲得的組織學(xué)特征進(jìn)行比較。結(jié)果表明，這些代謝物的分布與組織病理學(xué)腎臟病變表現(xiàn)出良好的空間匹配性。

圖6.OPLS-DA分析

表2

4.討論

4.1 精氨酸-肌酸代謝途徑和尿素循環(huán)的改變

精氨酸、肌酐的增加表明AAI可導(dǎo)致精氨酸-肌酸代謝途徑上調(diào)，同時(shí)髓質(zhì)中亞精胺濃度的增加也表明AAI可導(dǎo)致尿素循環(huán)代謝途徑的功能障礙，這與先前的研究發(fā)現(xiàn)一致（圖7）。

圖7.精氨酸肌酐代謝途徑中代謝物空間分布

4.2 膽堿代謝紊亂

在AAI治療大鼠的腎皮質(zhì)和延髓中膽堿和甘油磷酸膽堿增加，而在腎外髓質(zhì)中甜菜堿和脯氨酸甜菜堿降低，這表明在AAI治療的大鼠中有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生改變（圖8）。

圖8.膽堿代謝相關(guān)的代謝物的空間分布

4.3 脂質(zhì)代謝紊亂

腎髓質(zhì)中肉堿和棕櫚酰肉堿的濃度顯著增加，尤其是在AAI治療的大鼠的腎臟的近髓質(zhì)皮層中（圖9）。肉堿的積累和亞油酰基肉堿的減少表明AAI會(huì)導(dǎo)致腎臟線粒體功能障礙，各種脂質(zhì)的上調(diào)或下調(diào)也表明AAI可導(dǎo)致脂肪酸代謝紊亂。

圖9.脂質(zhì)代謝相關(guān)的代謝產(chǎn)物的空間分布

4.4 對(duì)N-乙酰組胺、磷酸絲氨酸、肌苷和果糖基賴氨酸代謝的影響

N-乙酰組胺在腎臟近髓質(zhì)皮層中上調(diào)，表明AAI可能引起了腎臟近髓質(zhì)皮層的類過敏反應(yīng)；近髓質(zhì)皮層中磷酸絲氨酸的上調(diào)可能反映了絲氨酸合成的增加或腎臟過濾的改變；AAI治療可導(dǎo)致腎髓質(zhì)中肌苷降低，肌苷是氧化應(yīng)激的標(biāo)記，表明AAI可能導(dǎo)致腎臟線粒體功能障礙和能量代謝的中斷；AAI治療大鼠中果糖基賴氨酸降低，可能反映了AAI治療的大鼠中腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的改變（圖10）。

圖10. N-乙酰組胺、磷酸絲氨酸、肌苷和果糖基賴氨酸的空間分布

目前尚不清楚AAI治療大鼠腎臟組織中不同代謝物變化的潛在機(jī)制。但大多數(shù)代謝物含量和分布的變化似乎與線粒體功能障礙有關(guān)，可能是由于AAI暴露引起腎小管上皮細(xì)胞中的線粒體損傷，從而導(dǎo)致線粒體脂質(zhì)代謝功能異常，能量代謝中斷，ATP依賴性腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性改變，細(xì)胞凋亡。此外在病變區(qū)域發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)代謝產(chǎn)物為脂質(zhì)，這表明脂質(zhì)代謝產(chǎn)物可能成為AAs致腎毒性的生物標(biāo)志物。

本研究開發(fā)了一種基于AFADESI-MSI的原位代謝組學(xué)方法用于研究由AAI引起的腎毒性的潛在分子機(jī)制，該方法能夠高通量和高分子特異性的可視化內(nèi)源性代謝物的分布和變化，且無需標(biāo)記和復(fù)雜的樣品預(yù)處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AAI治療的大鼠中有38種代謝物的分布發(fā)生了顯著變化。通過AFADESI-MSI分析獲得的分子圖像與組織學(xué)染色對(duì)比，有助于發(fā)現(xiàn)與藥物毒性密切相關(guān)的生物標(biāo)志物。

Wang Z , He B , Liu Y , et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging[J]. Acta Pharmaceutica Sinica. B, 2020, 10(6).

AAs：Aristolochic acids，馬兜鈴酸；AFADESI-MSI：air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging，基于空氣動(dòng)力輔助離子化的質(zhì)譜成像技術(shù)；Upr：urine protein，尿蛋白（Upr）；Ucr：creatinine，肌酐。