技術文章
使用Cary 3500表征抗體藥物偶聯物的關鍵質量屬性
閱讀:147 發布時間:2024-11-14摘要抗體藥物偶聯物 (ADCs) 是一類快速增長的生物治療藥物。在生產過程中,需要監測ADCs 的關鍵質量屬性 (CQAs),例如藥物/抗體比率 (DAR) 和聚集體。本應用簡報展示了 Agilent Cary 3500 紫外-可見多池分光光度計在分析 ADCs 的 DAR 和聚集指數方面的功能優勢,以及在多種溫度下同步測量多個樣品的功能。Cary 3500 紫外可見分光光度計憑借軟件中的自定義方程功能、簡單的方法和準確的溫度控制,能夠輕松、可靠地測定 DAR 和聚集指數。
前言ADCs 憑借特異性和靶向作用模式,成為制藥公司藥物研發管線中快速增長的一類生物治療藥物[1]。通過測定 DAR 可確定與每個抗體偶聯的細胞毒性小分子的平均數量,該值對產品的安全性和有效性有很大的影響,因此通常被視為一種 CQA。研究表明,DAR 還會顯著影響產物形成聚集體的趨勢[2],從而引起免疫反應。因此,在開發過程中分析 ADCs 的 DAR 和聚集體至關重要。紫外-可見光譜是生物制藥實驗室中的一種常用技術,常用于可靠、便捷地測定蛋白質濃度。在本應用簡報中,我們證明了只要細胞毒性小分子含有紫外-可見發色團,并且其最大吸收波長與抗體支架不同,那么紫外-可見光譜法也可用于測定ADC 的 DAR[1]。Cary 3500 紫外-可見分光光度計使用簡單快捷,具有高通量,并且可同時在四種不同的溫度下為四對比色皿提供準確的溫度控制。同步測量多個樣品的紫外吸光度可消除不利變量,提高所生成結果的可靠性。簡單的方法設置和定制計算功能便于用戶使用。Cary 3500 紫外-可見分光光度計與 Agilent OpenLab軟件套裝兼容。在配置 OpenLab 軟件后,它可以支持實驗室遵循 FDA 21 CFR Part 11 法規認證指南。在本研究中,我們展示了 Cary 3500 紫外-可見分光光度計在測定 DAR 和聚集指數方面的優勢。
實驗部分儀器Agilent Cary 3500 紫外-可見多池分光光度計,配有八個比色皿位置。使用 Cary UV Workstation 軟件(1.0.1284 版)和Cary 3500 多區控溫附件進行數據采集,所用參數如表 1 所示。
赫賽汀及其 ADC 類似物購自新加坡當地的經銷商。兩種單克隆抗體 (mAb) 樣品均使用 Vivaspin 500 超濾濃縮離心管離心柱 (10 kDa MWCO; Sartorius) 進行濃縮。安捷倫矩形 UV 比色皿,10 mm,700 µL,開口(貨號 5061-3391)與 Cary 3500 紫外-可見分光光度計配套使用。新制超純水產自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Merck Millipore)的 Milli-Q Integral 水純化系統。
方法實驗中所用赫賽汀及其 ADC 類似物的濃度為 0.5 mg/mL。為了演示 DAR 值的變化,以不同的比例混合赫賽汀及其 ADC 類似物(見圖 2 中的表格),并使用 Cary 3500 紫外-可見分光光度計進行測量。使用 Cary UV Workstation 軟件中的公式 1 計算 DAR。為了研究溫度對 DAR 的影響,使用多區控溫附件平行進行了四個實驗(圖 1)。使用 280 nm 處的紫外吸光度,估算得到本實驗中所用的“經離心柱濃縮"ADC 的濃度為 25 mg/mL。對于 25 mg/mL 樣品,用 390 µL 水將 10 µL 樣品稀釋 40 倍。將稀釋后的 400 µL ADC 轉移到四個比色皿中,用 Cary 3500紫外-可見分光光度計在 60、70、80 和 90 °C 下同步孵育90 分鐘。在進行基線校正后測量樣品的吸光度,并用公式 1計算 DAR 值。為了研究聚集效應隨時間的變化,用 390 µL 水將 10 µL25 mg/mL 的樣品稀釋 40 倍。將稀釋后的 400 µL ADC 轉移到比色皿中,在 Cary 3500 紫外-可見分光光度計中孵育 90 分鐘,并以不同的時間間隔測量樣品的吸光度。使用公式 2 計算聚集指數。
結果與討論使用 Cary 3500 紫外-可見分光光度計測定藥物/抗體比率為了模擬 ADC 的偶聯過程,將 ADC 和游離抗體以不同的比例混合,并使用 Cary 3500 紫外-可見分光光度計測定 DAR。圖 2 顯示了 ADC 和未偶聯抗體混合物的紫外-可見光譜圖。使用公式 2 計算 DAR。ADC 的藥物分子 DM1 在 252 nm 處有強吸收,與赫賽汀主要發色團在 280 nm 處的吸收不同[4],如圖 2 所示。正如預期的那樣,DAR 值隨著溶液中 mAb 和 ADC的比例不同而發生變化。