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PCR試劑盒基本反應(yīng)步驟及其注意事項(xiàng)說(shuō)明
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。
在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。
PCR試劑盒由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。
2、模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。
3、引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列超過(guò)1000萬(wàn)倍，在使用Taq酶時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
TaqDNApolymerase在PCR過(guò)程中每循環(huán)的出錯(cuò)幾率約為2.2×10-5，對(duì)于大于1kb的DNA的片段的克隆推薦使用出錯(cuò)幾率更低的DNA聚合酶。對(duì)于普通的PCR或RT-PCR定性檢測(cè)或定量檢測(cè)，TaqDNApolymerase是理想選擇。
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