1.樣品處理(樣本處理區)
1.1樣本前處理
每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm 離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;棉拭子直接取100μL提取。
1.2RNA提取
推薦采用RNA提取試劑盒(離心柱提取法),請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制(試劑準備區)
根據待檢測樣本總數,設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照;樣品每滿7份,多配制1份),每測試反應體系配制如下表:
試劑AIV-H7N9 反應液 酶液
用量20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中,21uL/管。
3.加樣(樣本處理區)
將步驟1提取的RNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR擴增(核酸擴增區)
4.1將待檢測反應管置于熒光定量PCR 儀反應槽內;
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為25μL;熒光通道選擇:檢測通道(Reporter Dye)FAM、CY5,淬滅通道(Quencher Dye)選擇NONE,ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光,選擇None即可。
4.3推薦循環參數設置:
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1cycle 95℃ 10min 否
3 40cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop 值(一般可在5~20范圍內調節),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。
5.2結果判斷
FAM通道為禽流感病毒H7N9亞型H7基因檢測結果,CY5通道為禽流感病毒
H7N9亞型N9基因檢測結果
陽性:檢測通道Ct值≤35.0,且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑:檢測通道Ct值>35.0,且出現明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗,重復試驗結果出現Ct值≤35.0和明顯擴增曲線者為陽性,否則為陰性。
陰性:樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6.檢測方法的局限性
樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;
陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;
病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;
不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;
試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定
量檢測不準確的結果;
本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質控標準
陰性質控品:無明顯擴增曲線且無Ct值顯示;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且Ct值≤32;
以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。