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上海晅科生物科技有限公司>>技術文章>>漢坦病毒通用型(HTV-U)核酸檢測試劑盒使用方法

漢坦病毒通用型(HTV-U)核酸檢測試劑盒使用方法

閱讀:94        發布時間:2024/12/16
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【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區)

1.1樣本前處理

血液:直接取 100μL 于滅菌離心管中或取血清 100ul 于滅菌離心管中尿液:取 100μL 于滅菌離心管中;

組織樣品:稱取組織樣品約 0.5g,置于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨,勻漿后取 100μL于 1.5mL 滅菌離心管中;

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的核酸提取試劑(離心柱法)進行核酸提取,請按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制(試劑準備區)

根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下:

試劑HTV-U 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL/管。

3.加樣(樣本處理區)

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.PCR 擴增(核酸擴增區)

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;

4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;熒光通道選擇:

檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光, 選擇 None 即可。

4.3推薦循環參數設置:

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min

21 cycle95℃2min

345 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應結束后自動保存結果,根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據實際情況自行調整,Start 值可設在 3~15、End 值可設在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數期,陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數增長曲線; 陰性:樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數增長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

3.陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;

7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。


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