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鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒說明書
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提供商
上海晅科生物科技有限公司
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資料類型
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【產品名稱】
通用名稱:鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name :Duck Plague Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
鴨瘟,又稱鴨病毒性腸炎,是由皰疹病毒科鴨瘟病毒(Duck Plague Virus, DPV) 引起的一種急性(有時呈慢性)鴨、鵝和天鵝接觸性傳染病。其特征為體溫升高,兩腿麻痹,下痢,流淚和部分病鴨頭頸腫大。食道粘膜有小出血點,并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍,泄殖腔粘膜充血出血水腫和假膜覆蓋。肝有不規則大小不等的出血點和壞死灶[1]。本病傳播迅速,發病率和死亡率高,嚴重威脅養鴨業發展。
本試劑盒適用于檢測病鴨血液、口腔偽膜及潰瘍處粘液、肝、脾、腎等組織樣品 等樣本中的鴨瘟病毒,用于鴨瘟病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對鴨瘟病毒基因組保守區設計特異性引物和探針[1-3],用熒光 PCR 技術對鴨瘟病毒的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名稱規格
酶液50μL×1 管
DPV 反應液500μL×2 管
DPV 陽性質控品50μL ×1 管
陰性質控品250μL ×1 管
注:
1)不同批號試劑不能混用。
2)試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
在發病早期,無菌采集病鴨血液或刮取口腔偽膜及潰瘍處粘液;在動物死亡后,無菌采取肝、脾、腎等組織樣品
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區)
1.1樣本前處理
組織樣品:每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;粘液直接取 100μL 提取
1.2DNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的 DNA 提取試劑盒(離心柱提取
法),請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制(試劑準備區)
根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
試劑DPV 反應液酶液
用量(樣本數為 N)20μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21uL/管。
3.加樣(樣本處理區)
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR 擴增(核酸擴增區)
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye) NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置:
步驟循環數溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像調節Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數增長曲線;
可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38, 且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6.質控標準
陰性質控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
?樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;
?樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;
?陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;
?病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;
?不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;
?試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定 量檢測不準確的結果;
?本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行;
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;
3.反應液應避光保存;
4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通 則》進行處理。
【參考文獻】
[1]國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T-2744-2010 鴨病毒性腸炎檢疫技術規范[S]. 北京: 科學出版社, 2010.
[2]索化夷, 湯承, 岳華, 等. 實時熒光定量TaqMan-PCR 檢測鴨瘟病毒方法的建立[J]. 中國預防獸醫學報, 2006.
[3]馬騰飛. 鴨瘟病毒熒光定量 PCR 檢測方法的建立及其強弱毒株 UL2 基因差異分析[J]. 山東農業大學, 2015.