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【產品名稱】

商品名稱：布魯氏桿菌（Brucella）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Brucella Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌屬（Brucella）引起的全-世界范圍內流行的人畜共患病。布魯氏桿菌可感染多種家畜和野生動物，同時也可感染人，特別是羊布魯氏桿菌對人的威脅最大，引起相似的臨床癥狀和病理損傷，    如不孕-不育、流產、關節炎、睪丸炎及各種組織的局部病灶等，導致巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題[1]。

本試劑盒適用于檢測羊種、牛種、豬種和犬種血液、動物組織或土壤、物體表面等標本中的布魯氏桿菌，

用于布魯氏桿菌感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對布魯氏桿菌特異性引物，結合一條特異性探針， 用熒光 PCR 技術對布氏桿菌的 DNA 進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染病料的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規格25T/盒50T/盒

Brucella 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

Brucella 陽性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

血液標本：抽取動物靜脈血 3 mL~5 mL 放入帶蓋的 EDTA 抗凝管中并做好標記送檢。

動物組織標本：無菌操作取動物的肝、脾組織 2 g~5 g，放入無菌容器中，并標記取樣日期及部位。土壤或粉末狀標本：無菌操作用采樣勺取 2 g~5 g  標本置于無菌容器中密封保存。

物體表面標本：采用無菌生理鹽水濕潤的無菌拭子擦拭物體表面(以 100 cm2 為宜)，放入無菌容器中保存。

【保存和運輸】

上述標本在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區）

1.1樣本前處理

血液標本：無需前處理，可直接用于 DNA 提取。

動物組織標本取 0.25 g 標本,加人 0.5 mL 無菌生理水，勻漿，靜置 10 min,取上清液備用。

土壤或粉末狀標本：取 0.25 g 標本，加入 0.5 mL 無菌生理鹽水，振蕩搖勻，靜置 10 min，取上清液備用。

物體表面標本：采集的標本用 0.5 mL 無菌生理鹽水洗滌，振蕩搖勻，靜置 10 min，取上清液備用。

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書    進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿

10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑Brucella 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環參數設置：

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果無 Ct 值，且無特異性擴增曲線；

可疑：樣本檢測結果 40＜Ct 值≤45，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 40<Ct 值≤45，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性。

5.3質控標準

陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]王利清. 布氏桿菌病的診斷及防控[J]. 農業技術與裝備, 2011.

[2]國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 1088-2010 布氏桿菌檢疫技術規范[S]. 北京:中國標準出版社, 2010.

[3]GB/T 18646-2018,  動物布魯氏菌病診斷技術[S].