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目錄:上海牧榮生物科技有限公司>>實驗試劑>>酶類>> E3006Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒

Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒
  • Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒
參考價 面議
具體成交價以合同協議為準
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具體成交價以合同協議為準
  • 品牌 New England Biolabs/NEB
  • 型號 E3006
  • 廠商性質 代理商
  • 所在地 上海市
屬性

供貨周期:現貨 貨號:E3006

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更新時間:2024-11-12 11:36:20瀏覽次數:229評價

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供貨周期 現貨 貨號 E3006
NEB于2021年4月開始將我們的含BSA的反應緩沖液轉換為含有用于限制性酶和一些DNA修飾酶的重組白蛋白(rAlbumin)的緩沖液。Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒

Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒

此試劑盒還提供無 ROX 劑型,適用于無需 ROX 惰性參比染料的儀器。

使用探針法 qPCR,快速、靈敏、精確地對靶標 RNA 進行檢測和定量。

選擇更簡單

  • 一種應用對應一種產品,簡化選擇

  • 方便的預混液劑型及易操作的實驗步驟使反應體系的建立更便捷

  • 無干擾、可視化示蹤染料,避免加樣失誤

產品性能優異

  • Luna® 系列所有產品均經過嚴格測試,以優化產品的特異性、靈敏度、精確性和可重復性

  • 該產品對于不同來源的樣品均具有穩定的性能

  • 通過與市面上其它 qPCR 和 RT-qPCR 試劑的綜合評測,Luna 產品展現了好的性能

使用 Luna WarmStart® 反轉錄酶優化您的 RT-qPCR 實驗

  • 新型熱穩定的反轉錄酶(RT)能夠有效提高實驗表現

  • WarmStart 反轉錄酶與熱啟動 Taq 酶共同提升反應特異性和穩定性


NEB Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒經過優化,適用于水解探針法的目標 RNA 序列實時定量。一步法 RT-qPCR 為 RNA 檢測和定量提供了一種便捷、強大的方法。在同一管中,RNA 首先由反轉錄酶轉化為 cDNA,然后使用 DNA 依賴型 DNA 聚合酶擴增 cDNA,從而可以進行 qPCR 定量。探針法 qPCR/RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5′→3′ 核酸外切酶活性,將淬滅的目標特異性探針切斷發出熒光,并實時監測熒光值的增加,以測量每個循環中的 DNA 擴增。在熒光信號顯著超過背景熒光的位置,可以確定循環數或 Cq 值。Cq 值可用于評估兩個或多個樣品的靶基因相對豐度,通過已知稀釋濃度樣品的標準曲線,可對靶基因進行絕對定量。

在 Luna 通用一步法探針 RT-qPCR 試劑盒中,聯合使用熱啟動 Taq DNA 聚合酶與新型 WarmStart 反轉錄酶,通過適配體可逆抑制來雙重控制酶活性。這種溫控活化機制可避免熱循環前的非特異擴增,從而讓室溫建立體系更安全。經改造的 Luna WarmStart 反轉錄酶的熱穩定性比許多反轉錄酶更高,其最佳反應溫度為 55℃。對于困難靶標/模板,最多可將反轉錄步驟的溫度升至 60℃,不會影響 Luna 性能。

注意:為確保 Luna WarmStart 反轉錄酶全激活,建議溫育溫度不低于 50℃。

Luna 通用探針一步法反應混合液濃度為 2X,包含熱啟動 Taq DNA 聚合酶、dNTP 和所有必需的緩沖液成分。該預混液包含惰性參比染料,可與多種 qPCR 儀器兼容,包括需要高 ROX 或低 ROX 參比信號的儀器。特色的是:預混液還包含可防止交叉污染的 dUTP,以及有助于觀察反應體系建立的非熒光可見示蹤染料。該示蹤染料與 qPCR 常用熒光團的光譜沒有重疊,因此不會干擾實時檢測。

Luna WarmStart 反轉錄酶預混液的濃度為 20X,其中包含 Luna WarmStart 反轉錄酶以及用于防止 RNA 降解的小鼠 RNase 抑制劑(詳情請見產品手冊中的模板制備)。適用于各種 RNA 樣品類型(總 RNA、poly(A)-RNA 等)和來源。

.圖 1:NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒具有更高的靈敏度、更出眾的可重復性以及更優異的 RT-qPCR 表現

Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒

使用 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒,執行了人 GAPDH 基因的 RT-qPCR 靶標檢測,起始量模板為 8 個 10 倍梯度稀釋的 Jurkat 總 RNA(1 μg – 0.1 pg),每個濃度的樣品做 8 個重復。實驗按照試劑盒建議的操作流程進行,反應中包含一個 55℃ 溫育 10 分鐘的反轉錄步驟,以便于具有熱穩定性的 Luna WarmStart 反轉錄酶發揮作用。


圖 2:NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒在多重檢測中展現強大功效

Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒

使用 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒,執行了人 GAPDH 基因、核糖體蛋白 L32g 和 PI3 激酶相關的激酶 SMG1 基因的多重 RT-qPCR 靶標檢測。起始量模板濃度為 7 個 10 倍稀釋的 Jurkat 總 RNA(1 μg – 1 pg),每個濃度的樣品做 4 個重復。擴增圖表如上所示,左邊是疊加的結果,右邊是每個基因單獨的檢測結果。若要解釋拷貝數的差異,低拷貝的模板(SMG1)使用的引物濃度為 0.4 µM,高拷貝的模板(L32g 和 GAPDH)使用的引物濃度為 0.2 µM。Luna 產品在多重 RT-qPCR 檢測中展現出效率、可重復性、靈敏度和性能。

圖 3:通過與市售的探針法 RT-qPCR 試劑相比,Luna 產品展現出更好的穩定性和特異性

Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒


使用市售的 RT-qPCR 試劑對 7 個不同豐度、長度和 GC 含量的 RT-qPCR 靶標進行測試。測試均根據產品說明書進行,數據來源于兩位實驗人員。從以下方面評估了反應結果:擴增效率、低起始量檢測能力及無模板擴增值(ΔCq = 無模板對照的平均 Cq – *低起始量的平均 Cq)。此外,還評估了擴增結果的一致性、可重復性和總體曲線質量(質量分數)。柱狀圖展示了達到可接受的性能標準的目標百分比(由點圖上的綠色框表示,質量分數 > 3)。NEB 和其它供應商的結果如下所示:Quanta,qScript™ XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix®;ABI,TaqMan® RNA-to-Ct 1-Step Kit;QIAGEN,QuantiFast® Probe RT-PCR Kit;Bio-Rad,iTaq™ Universal Probes One-Step Kit;Promega®,GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System。NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒性能優于其它測試試劑。



本產品提供以下試劑或組分:

NEB #名稱組分貨號儲存溫度數量濃度

  • E3006S

    -20



    Luna® WarmStart® RT Enzyme MixM3002SVIAL-201 x 0.2 ml20 X

    Luna® Universal Probe One-Step Reaction MixM3006SVIAL-202 x 1 ml2 X

    Nuclease-free WaterB1502AVIAL-201 x 1.5 mlNot Applicable

  • E3006L

    -20



    Luna® WarmStart® RT Enzyme MixM3002LVIAL-201 x 0.5 ml20 X

    Luna® Universal Probe One-Step Reaction MixM3006SVIAL-205 x 1 ml2 X

    Nuclease-free WaterB1502AVIAL-203 x 1.5 mlNot Applicable

  • E3006X

    -20



    Luna® WarmStart® RT Enzyme MixM3002LVIAL-202 x 0.5 ml20 X

    Luna® Universal Probe One-Step Reaction MixM3006SVIAL-2010 x 1 ml2 X

    Nuclease-free WaterB1502AVIAL-206 x 1.5 mlNot Applicable

  • E3006E

    -20



    Luna® WarmStart® RT Enzyme MixM3002EVIAL-202 x 1.25 ml20 X

    Luna® Universal Probe One-Step Reaction MixM3006EVIAL-201 x 25 ml2 X

    Nuclease-free WaterB1502EVIAL-201 x 25 mlNot Applicable
  • 注意事項

    1. 引物設計
      使用 qPCR 引物設計軟件(如 Primer3),可在盡力減少非特異性擴增和引物二聚體的情況下提高擴增成功率。GC/AT 含量平衡(40 – 60%)的靶標,往往具有最高的擴增效率。若可行,盡量多輸入目標周圍區域序列,以便引物序列設計更加完善,同時使用檢索功能,檢索相關序列數據庫(避免潛在的非特異性擴增)。建議在已知的 RNA 剪接位點范圍內設計引物,防止基因組 DNA 擴增。

    2. 引物和探針濃度
      對大多數靶標而言,400 nM(每個引物)的終濃度就可以提供最佳性能。如有必要,可以在 100 – 900 nM 范圍內優化引物濃度。為獲得最佳結果,探針應包括在 200 nM 的范圍內??梢栽?100 – 500 nM 范圍內優化探針濃度。

    3. 多重檢測
      在確定要納入多重檢測反應中的熒光團時,一定要選擇兼容的熒光發光基團和熒光吸收基團(例如,所選實時儀器可以容納且熒光光譜重疊度最?。?。若為依賴 ROX 的儀器,避免使用 ROX 標記的探針。包含 400 nM 的正向和反向引物,以及反應中要檢測的各靶標的 200 nM 探針。對于豐度差異較大的靶標,推薦對豐度較高的靶標使用較低的引物濃度(如 200 nM)。如有必要,根據性能調整濃度(引物 100 – 900 nM,探針 100 – 500 nM)。將 qPCR 方案加載到實時儀器上時,一定要選擇適當的光學通道,因為有些儀器的單通道記錄模式會妨礙多重檢測數據的收集和分析。在嘗試進行多重檢測之前,應單獨測試引物和探針組的功能。

    4. 擴增子長度
      為確保成功獲得一致的 qPCR 結果,最大限度地提高 PCR 效率非常重要。其中一個重要方面就是設計短片段 PCR 擴增子(通常為 70 – 200 bp)。如果靶標超出范圍,可能需要對實驗進行優化。

    5. 模板制備及相關濃度
      Luna RT-qPCR 與通過傳統核酸純化方法制備的 RNA 樣品兼容。為保障長效穩定性,制備好的 RNA 應儲存在含有 EDTA 的緩沖液中(如 1X TE);稀釋液應在 qPCR 實驗前采用 TE 或水新鮮制備。注意:RNA 模板質量會對 RT-qPCR 效率產生極大的影響。處理 RNA 時應采取適當的預防措施,防止 RNase 或 DNase 污染。強烈推薦使用(提供的)無核酶水。若可行,可使用 DNase I 處理 RNA,將殘留基因組 DNA 除去。
      一般來說,標準品和未知樣品的有效濃度范圍應該在 108 拷貝到 10 拷貝之間。注意:根據泊松分布,對于單拷貝范圍內的稀釋液,某些樣品會包含多個拷貝,某些則不含拷貝。對于總 RNA,Luna 一步法試劑盒可以在 8 個濃度梯度的起始量范圍內(1 μg – 0.1 pg)提供良好的線性定量能力。對于大多數靶標,推薦使用 100 ng – 10 pg 的總 RNA 標準起始量范圍。對于經純化的 mRNA,推薦起始量 ≤ 100 ng。對于體外轉錄的 RNA,推薦起始量 ≤ 109 拷貝。

    6. ROX 參比染料

      對于某些實時儀器,建議使用惰性參比染料(通常是 ROX)來避免儀器限制(例如“邊緣效應"、氣泡、微小體積差異以及反應過程中塵?;蛭⒘5淖园l熒光)造成的孔與孔之間的反應誤差。不過,對于模板/引物的加樣錯誤、異質混合液和蒸發/凝結問題造成的誤差,ROX 校正幾乎不起作用。

      以下 Luna® qPCR 產品包含通用惰性參比染料:Luna 通用 qPCR 預混液(NEB #M3003)、Luna 通用探針法 qPCR 預混液(NEB #M3004)、Luna 通用一步法 RT-qPCR 試劑盒(NEB #E3005)和 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒(NEB #E3006)。這些產品兼容多種儀器(高 ROX、低 ROX、無 ROX),因此無需額外的 ROX 來進行校正。

      Luna 探針一步法 RT-qPCR 試劑盒(無 ROX)(E3007)不含參比染料,與無需使用 ROX 的儀器兼容。如果需要 ROX 校正,可自行添加 ROX。如需詳細信息,請參閱儀器廠商說明書。

    7. 防止交叉污染
      RT-qPCR 是一種非常靈敏的方法,在新的 RT-qPCR 測定中,之前擴增反應的產物污染會導致各種問題,例如假陽性結果和靈敏度降低。防止這種“交叉"污染的最好辦法就是嚴格按照實驗程序操作,避免擴增后打開反應容器。不過,為進一步滿足預防污染的要求,Luna qPCR 混合液中包含了 dUTP/dTTP 混合物,從而可在擴增過程中將 dU 結合到 DNA 產物中。用尿嘧啶-DNA 糖基化酶(UDG)對 qPCR/RT-qPCR 實驗進行預處理,通過切除尿嘧啶堿基來消除之前擴增的含尿嘧啶的產物,從而產生不可擴增的 DNA 產物。使用熱敏 UDG 至關重要,因為需要將 UDG 全滅活,防止其破壞新合成的 qPCR 產物。

      為防止交叉污染,應在反應混合液中添加終濃度為 0.025 U/μl 的南極熱敏 UDG(
      NEB #M0372)。要最大限度地消除污染產物,可在室溫下進行 qPCR 實驗,或在進行初始變性之前在 25℃ 條件下溫育 10 分鐘。

    8. 反應體系建立與循環條件
      Luna 一步法試劑盒具有雙重熱啟動功能,因此無需在冰上建立反應體系或在使用前預熱熱循環儀。
      如果采用 96 孔板,推薦使用 20 μl 最終反應體積。
      如果采用 384 孔板,推薦使用 10 μl 最終反應體積。
      對儀器循環條件進行編程時,確保在延伸結束時讀取模板讀數,并在循環完成后繪制變性(融化)曲線,以分析產物特異性。
      大部分應用只需 40 個循環的擴增,但低起始量樣品可能需要 45 個循環。




上海牧榮生物科技有限公司是一家集成服務商,公司堅持“一站式"服務模式,為客戶全面解決實驗、生產、開發需求。公司整合國際與國內資源,加強網絡建設,提高公司內部運作效率,為客戶提供方便、快捷的服務。



實驗試劑的注意事項:

(1)切忌與皮膚直接接觸。

(2)要用潔凈的專用取用試劑,用同一種工具不允許同時連續取用多種試劑。應取完一種試劑后,將工具洗凈(藥勺要擦干)后,才可取用另一種試劑。

(3)易燃易爆性化學試劑必須存放于專用的危險性試劑倉庫里,并存放在不燃燒材料制作的柜、架上,溫度不宜超過28℃,使用時要穿好必要的防護用具實驗室少量瓶裝可設危險品專柜,按性質分格貯存,同一格內不得混放氧化劑等性質的抵觸品,并根據貯存種類配備相應的滅火設備和自動報警裝置。低沸點極易燃燒試劑宜低溫下貯存(5℃以下,禁用有電火花產生的普通家用電冰箱貯存。

(4)強腐蝕類 存放處要求陰涼通風,并與其他藥品隔離放罟。

(5)強氧化劑試劑是過氧化物或含氧酸及其鹽,在適當條件下會發生爆炸,并可與有機物、鎂、鋁、鋅粉、硫等易燃固體形成爆炸混合物。(存放處要求陰涼通風,溫度不得超過30℃℃。

(6)放射性類 一般化驗室不可能有放射性物質。化驗操作這類物質需要特殊防護設備和知識以保護人身安全,并防止放射性物質的污染與擴散




Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒








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