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eppendorfPCR儀售后維修.艾本德(全國服務(wù))

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  • 品牌 eppendorf/德國艾本德
  • 廠商性質(zhì) 其他
  • 所在地 廣州市
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更新時(shí)間:2022-01-06 14:50:19瀏覽次數(shù):355

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產(chǎn)地類別 進(jìn)口 價(jià)格區(qū)間 1-3.5萬
儀器種類 其它PCR儀 應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè),地礦
本公司位于廣州市番禺區(qū),子公司遍及“華南"“華北"“華中"地區(qū),我司有著深厚的技術(shù)及經(jīng)驗(yàn),各部門實(shí)行崗位責(zé)任制、獎(jiǎng)罰責(zé)任制、績(jī)效考核制、每位員工統(tǒng)一服裝、統(tǒng)一工作牌。真正做到公司及合作廠家的形象化、制度化、網(wǎng)絡(luò)化、信息化;讓每位用戶享受到真誠、優(yōu)質(zhì)、高效、便捷的貼心服務(wù)。

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eppendorfpcr儀反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系: 10×擴(kuò)增緩沖液   10ul 4種dNTP混合物   各200umol/L 引物        各10~100pmol 模板DNA       0.1~2ug Taq DNA聚合酶   2.5u Mg2+       1.5mmol/L 加雙或三蒸水至   100ul PCR反應(yīng)五要素: 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物: 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。
 理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。
  設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則: ①引物長(zhǎng)度: 15-30bp,常用為20bp左右。
  ②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
  ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。
ATGC好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
  ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3’端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
  ⑤引物3’端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列好有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
  ⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
  引物量: 每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
  酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。
 催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
  dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。
dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。
HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0~7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。
 多次凍融會(huì)使dNTP降解。
 在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低),就會(huì)引起錯(cuò)配。
 濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。
dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。
  模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。
SDS的主要功能是: 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。
 提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。
 一般臨床檢測(cè)標(biāo)本,可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接 用于PCR擴(kuò)增。
RNA模板提取一般采用異胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。
  Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。
Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

eppendorfpcr儀 - 工作原理;
類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。
 每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

eppendorfpcr儀熒光化學(xué) 
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。
 現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下:
1)熒光探針:PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。
 探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

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