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Rho1D4純化體系：為重組膜蛋白提取設計
膜蛋白的重要性不言而喻，假如細胞膜是守護細胞的城墻，而膜蛋白就是站在城墻上的各司其職的士兵，肩負著把守城門、傳遞信號、運輸物質等重要職責。膜蛋白一旦“失守"，就會造成細胞功能紊亂，進而引起組織和器官發生病變，使身體遭受病痛侵擾。這也就是為什么膜蛋白成為大多數重要的藥物研究對象和靶點。
在人體蛋白中，有大約30%是膜蛋白，FDA批準的新藥中，大多數都以膜蛋白為靶點，幾乎所有的膜蛋白都是研究熱點。然而讓人吃驚的是，樂觀估計，目前已經被透徹研究清楚結構的膜蛋白僅占膜蛋白總量的1%。
究其原因，是因為膜蛋白依附或橫跨在細胞膜的磷脂雙分子層上，使膜蛋白的表達、純化、結晶和結構分析都有很大難度。由于非常難以獲得高純度的膜蛋白，進而解析它們的結構和功能，使根據膜蛋白結構設計藥物的方法難以施展，而這種方法是目前開發藥物有效的方法之一，因為藥物要能有效治療并且使副作用盡量減小，作用位點就必須精準。
很多科研人員想深入研究膜蛋白，希望攻克困擾人類的各種疾病，但由于提取高純度目標膜蛋白并不便捷，從而影響研發進度。市面上有一些專用于膜蛋白提取的試劑盒，大多數只能提取某幾種類型的膜蛋白，有些試劑盒用于提取膜總蛋白（包括質膜和細胞器膜蛋白）。
目前，有一種新型膜蛋白提取工具能夠特異性親和純化重組膜蛋白，并具有高純度、高特異性、高載量、溫和提取的優點，是基于1980年科學家在牛眼視網膜中發現的一種命名為Rho1D4的氨基酸序列以及其對應的抗體來作為親和標簽純化膜蛋白取得了非常好的效果，將Rho1D4抗體鏈接在瓊脂糖或磁珠上，用于親和層析帶有Rho1D4標簽的膜蛋白，能解決這些研究難題。
1）什么是Rho1D4?
Rho1D4是指在牛眼視網膜細胞內的牛視紫紅質C端的后九位氨基酸。Rho1D4得名于與該序列特異性結合的單克隆抗體。與Rho1D4抗體結合的表位可以作為針對膜蛋白的高特異性純化標記。
通過基因修飾可在欲研究的目標（膜）蛋白C端加上Rho1D4標記（如圖1）。一旦加載上該序列，即可用裝載有Rho1D4抗體的親和基質去捕獲目標蛋白，隨后添加Rho1D4肽，通過競爭性結合基質抗體的方式來洗脫目標蛋白。采用這種方法，相比改變pH值等其他洗脫方式，更加地溫和。
圖1：假設有3個跨膜域的膜蛋白。Rho1D4標簽加到膜蛋白C端，它的序列是T-E-T-S-Q-V-A-P-A
2）Rho1D4的歷史
Rho1D4的表位和抗體配對于20世紀80年代被發現，當時科學家將Rho1D4抗體交聯包被在瓊脂糖凝膠上，用來純化通過猴腎細胞表達的牛視紫紅質。從那時起，Rho1D4系統開始被廣泛的用于小量膜蛋白提取的研究中，包括GPCR（G蛋白偶聯受體），ATP結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter），溶質反向轉運體和以及一種含四個跨膜域的膜蛋白。
3）Rho1D4系統的優勢和用途
高純度
Rho1D4系統包含：標簽、抗體偶聯親和基質（瓊脂糖或磁珠等）以及洗脫多肽。Rho1D4系統的優勢在于抗體與抗原相互作用的高度特異性。表位序列和鏈長對結合至關重要。例如，將第三位丙氨酸替換成甘氨酸，即移去一個甲基基團，抗體將不再與表位結合。同樣，完整的九個氨基酸標簽會與Rho1D4抗體結合緊密，去除兩個氨基酸則阻斷結合。因此，含有與Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特異性結合被盡量減少，因此回收蛋白的純度非常高。（見表1）
高回收量
而Rho1D4系統的另一個優勢是洗脫目標蛋白的高回收率。包括細菌，酵母和哺乳動物細胞系在內的表達系統已經針對特定的GPCR和其他膜蛋白進行了優化。用Rho1D4系統純化后的膜蛋白通過凝膠過濾以除去用于洗脫的多肽。使用此純化系統的科研人員均反饋蛋白回收量均達到毫克級。（見表1）
純化的膜蛋白可用于功能性研究
純化的蛋白可用于功能性研究，如配體結合的特性，蛋白與蛋白間的相互作用。例如，將標記過的ABCA4固定在載有Rho1D4抗體的基質上來確定它與天然配體（一種視網膜的加成物）的親和結合特性，加入ATP后即釋放。又例如，CD81蛋白被整體固定在涂有Rho1D4抗體的平板上，它表現出和分離可溶蛋白片段與丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的親和結合力。另外，有陰離子轉運載體AE1結構域的重組蛋白被標記且用Rho1D4系統純化后表現出與紅細胞來源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
4）利用Rho1D4純化膜蛋白圖解簡述
步驟1：
結合
將Rho1D4標記的蛋白與載有Rho1D4抗體的瓊脂糖一同孵育使得目標蛋白被固定在吸附材料上。
步驟2：
清洗
將雜蛋白和其他裂解液成分洗去，留下與親和基質結合的目標蛋白。
步驟3：
洗脫
過量Rho1D4肽與基質競爭性結合，釋放出目標蛋白在洗脫液中收集。
表1：膜蛋白應用實例
*純度是從低濃度經一步Rho1D4 IAC在反應溶液中得出的；產率是在洗脫成分濃縮并過SEC柱后計算的。
表1：有文獻報道的使用Rho1D4系統純化膜蛋白的純度和產率。盡管很多用Rho1D4系統純化的膜蛋白均為G蛋白偶聯受體家族，該系統也可以有助于辨別其他如轉運體之類的膜蛋白。相關文章在參考文獻中。IAC：免疫親和層析；SEC：排阻層析。
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