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細胞培養(yǎng)前的準備

無菌操作

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風10min，用75%酒精擦拭臺面，并開啟超凈工作臺風扇運轉數分鐘后，才開始實驗操作。

每次操作只處理一株細胞株，避免細胞間交叉污染。

實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，再次以 75% 酒精擦拭無菌操作臺面。實驗操作應在中央無菌區(qū)域，一般不要再邊緣區(qū)域操作。

器材耗材備足

在開始細胞培養(yǎng)之前，先檢查一下移液管和瓶子的數量是否充足，以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細胞污染的風險。

細胞培養(yǎng)基也應先預熱，選擇只預熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱，不但可以節(jié)約實驗時間，而且可以避免因反復加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質降解。

結束操作后，需盡可能避光保存。

細胞培養(yǎng)的定期檢查

定期檢查培養(yǎng)細胞的形態(tài)，即形狀和外觀，對于細胞培養(yǎng)實驗取得成功至關重要。

a.檢查培養(yǎng)液顏色與透明度的變化，顏色變黃，說明PH值下降；變紅或紫紅色，說明PH值上升，細胞生長停滯、死亡，一般生長穩(wěn)定的細胞2-3天換液一次，生長緩慢的細胞可3-4天換液一次。

b.觀察細胞生長狀態(tài)，細胞長滿瓶底的80-90%，應及時傳代。

c.觀察細胞形態(tài)變化，細胞透明度大、折光性強、輪廓清晰為佳。

除確認細胞的健康狀態(tài)外，每次操作細胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象，避免污染擴散至實驗室其他細胞。

注意微生物污染，常常出現(xiàn)培養(yǎng)液混濁，液體內漂菌絲或細胞菌，不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物及細胞。

細胞變質的征象

細胞變質的征象包括核周出現(xiàn)顆粒、細胞與基質解離以及細胞質空泡形成。

這些變質征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染、細胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。

變質嚴重時將會成為不可逆的變化。

細胞培養(yǎng)通風櫥的消毒及布局

a.保持細胞培養(yǎng)通風櫥內的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內。

b.向放入通風櫥內的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進行消毒。

c.在通風櫥中部開闊處放置細胞培養(yǎng)容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸取；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。

培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作

無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時應將蓋子開口朝下放在工作臺面上。

進行無菌操作時不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實驗，以盡量避免污染。

細胞培養(yǎng)中可能的污染物

細胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類

a.化學污染物,如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質、內毒素、增塑劑和去污劑。

b.生物污染物，如細菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。

可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術，降低污染發(fā)生的頻率和嚴重程度。

細胞培養(yǎng)污染篩查

細胞被污染了途徑有以下幾個

a.空氣是微生物傳播的最主要途徑，操作時盡量避免說話、咳嗽、打噴嚏；

b.使用的培養(yǎng)器械及器皿清洗消毒；

c.培養(yǎng)兩種以上細胞時，操作不規(guī)范，可能導致細胞交叉污染；

d.血清有問題，可能血清在生產時就已經被支原體或病毒污染；

e.原代培養(yǎng)的污染多數來源于組織樣本。

交叉污染的確認

交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題，會造成嚴重后果。

從聲譽好的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系性質及采用良好的無菌技術有助于避免交叉污染。

通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無交叉污染。

細胞換液注意事項

為細胞換液時，要沿著培養(yǎng)瓶的一側輕輕地加入，而不是直接加到細胞中，以免損傷細胞，當培養(yǎng)的細胞株較為脆弱時尤其需要注意。

使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。

細胞傳代的時間把握

當細胞呈指數增殖，貼壁培養(yǎng)的細胞已占據所有可用基質、沒有擴增空間，或懸浮培養(yǎng)的細胞已超過培養(yǎng)基質所支撐的能力，無法進一步生長時，細胞增殖速度將大大降低甚至停止。

細胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項

細胞培養(yǎng)時不應長期使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生，導致輕度污染持續(xù)存在。抗生素只能作為對付污染的最后手段短期使用，并盡快撤除。

如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。

細胞凍存的必要性

連續(xù)培養(yǎng)的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細胞系最終會發(fā)生衰老，所有培養(yǎng)的細胞都易受到微生物污染，即使運轉情況好的實驗室也會遇到設備故障的問題。

由于已建立的細胞系是一種寶貴資源，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間，因此，必須將其冷凍起來，長期保存。

細胞凍存的事項

應在細胞濃度高的情況下進行細胞培養(yǎng)凍存，并且細胞傳代的次數盡可能少。

在凍存前確保活細胞的百分比至少為90%。

請注意，最佳凍存條件取決于所用細胞系。

凍存和復蘇過程對大多數細胞都會造成不利影響，因此不要通過渦旋震蕩或者用。