今天推來自西方大學醫學生物物理學系成像研究實驗室和勞森健康研究所在2018年發表于Cell Discovery(2018IF：4.321，JCRQ2)的一篇文章，通訊作者是John J. Kelly和 John A. Ronald教授。
文章摘要
表達成像報告基因的細胞的無創分子遺傳成像是一種在臨床前模型和患者中縱向監測癌細胞的生物分布和活力以及基于細胞的療法的寶貴方法。然而，用報告基因標記細胞通常依賴于使用將報告基因隨機整合到基因組中的基因轉移方法，這可能會導致不必要的甚至嚴重的不利影響。為了克服這個問題，我們開發了 CRISPR-Cas9 工具來編輯腺相關病毒位點 1 (AAVS1) 安全港的細胞，其中包含編碼抗生素抗性基因和報告基因的大型供體構建體 (*6.3 kb) 用于生物發光 (BLI)和熒光成像。HEK293T 細胞在一個質粒中用編碼 Cas9 核酸內切酶和 AAVS1 靶向引導 RNA 的雙質粒系統轉染，以及編碼嘌呤霉素抗性基因、tdTomato 和螢火蟲熒光素酶的供體質粒，兩側是 AAVS1 同源臂。分離嘌呤霉素抗性克隆細胞，并通過 PCR 和 PCR 產物測序確認 AAVS1 整合。體外 BLI 信號與細胞數密切相關 (R2 = 0.9988; p < 0.05) 并且在多個傳代中保持穩定。將工程細胞 (2.5·106) 注射到裸鼠的左后腹，并在第 0、7、14、21 和 28 天進行體內 BLI。BLI 信號從第 0 天到第 7 天呈下降趨勢，但到第 28 天，由于細胞生長顯著增加 (p < 0.05)。這描述了第一個用于 AAVS1 整合大基因構建體的 CRISPR-Cas9 系統，用于體內細胞的分子遺傳成像。隨著進一步的發展，包括提高編輯效率、使用臨床相關報告基因，以及對其他可以在培養中容易擴增的細胞群(例如永生化細胞或 T 細胞)進行評估，這種 CRISPR-Cas9 報告基因系統可以廣泛應用于多項體內細胞追蹤研究。
研究背景
基于報告基因 (RG) 的細胞成像，也稱為分子遺傳成像，可以提供有關移植細胞在活體中的運輸、生物分布、活力和持久性的重要信息。可用的 RG 范圍涵蓋臨床前成像模式從熒光成像和生物發光成像 (BLI) 到磁共振成像、光聲斷層掃描和正電子發射斷層掃描 (PET) 等臨床模式。在疾病的臨床前模型中，基于 RG 的細胞跟蹤已經對疾病特征產生了重要的前瞻性，例如癌癥轉移和新療法對轉移性病變的治療效果，以及治療細胞向特定疾病位點的活力和遷移。細胞毒性 T 細胞在高級別膠質瘤患者中的活力。
RG 細胞成像涉及將 RG 整合到細胞的基因組中，以便在細胞的整個生命周期或任何潛在子細胞的生命周期內穩定地產生報告蛋白。這些報告產物的檢測提供了有關細胞位置/數量和細胞活力隨時間推移的重要間接信息。此外，基于如何調節 RG 表達，例如使用哪個啟動子。人們可以獲得有關細胞活化和/或分化的信息。雖然這是非常寶貴的信息，但也存在一個問題，工程過程中，與幼稚的細胞相比，細胞的行為可能會發生改變。例如，慢病毒載體是一種流行的工程細胞載體，因為它們具有大的轉基因能力，并且能夠容易地轉導多種分裂和非分裂細胞類型。然而，與大多數整合載體一樣，慢病毒載體在準引入基因隨機基因組位點有可能導致不想要的事件，例如癌基因激活差異剪接、通讀轉錄和異常轉錄。因此，在特定基因組區域設計具有 RG 的細胞的新穎、相對易于使用的工具將避免這些問題并具有很大的價值。
基因組編輯工具已經存在了幾十年，它允許將感興趣的轉基因整合到特定的基因組位點。其中兩種工具，鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALENs)。是成熟的基于蛋白質的系統，可在特定基因組位點引入雙鏈斷裂(DSB)。然后將編碼目的轉基因并通過同源臂連接到切割位點的供體 DNA 構建體共同引入可用于位點通過同源定向修復 (HDR) 進行定向整合。許多團隊已經利用這種策略來整合不同的 RG。此外，隨著安全基因組基因座的發現，研究人員有機會使用這些編輯工具進行安全轉基因。例如，幾個研究團隊已經用 RG 改造了細胞在腺相關病毒整合位點 1 (AAVS1) 使用 ZFN 和 TALEN。這是一個安全港，轉基因可以在不影響內源基因活性的情況下以可預測的方式整合和發揮作用。這一策略為消除任何潛在的有害影響打開了大門，但 ZFN 和 TALEN 的一個缺點是它們的設計和構造具有挑戰性且昂貴，這限制了它們的廣泛使用。
CRISPR* 和 CRISPR 相關蛋白 9 (Cas9) 于 2013 年成為基因組編輯工具，因為它比 ZFN 和 TALEN 更容易設計且實施成本更低。CRISPR/Cas9 系統利用 Cas9 核酸內切酶除了引導 RNA (gRNA) 之外，還可以在基因組的特定位點引入 DSB。這兩個組件可以在單個質粒中編碼，當與供體質粒配對時，還可以在感興趣的位點進行基于 HDR 的轉基因整合。重要的是，CRISPR/Cas9 也被證明比以前使用的編輯工具具有更高的效率。它還具有簡單的設計、高特異性和相對較高的效率，使其成為靶向整合 RG 的有前途的方法，進而對細胞進行惰性、安全和有效的分子遺傳成像。這項研究的目的是開發一種新的 CRISPR/Cas9 系統，以在 AAVS1 安全港對細胞進行工程改造，以共同表達選擇標記和雙模式 RG，并利用分子-基因成像。
方法和材料
AAVS1 靶向 CRISPR-Cas9 和供體質粒
pCas-Guide-AAVS1、pCas-Guide-Scramble 和 pAAVS1-puroDNR 構建體購自商業供應商 (OrigeneRockvilleMD)。pCas-Guide-AAVS1 質粒包含驅動 Cas9 核酸內切酶表達的巨細胞病毒啟動子 (pCMV)基因和 U6 啟動子驅動靶向 AAVS1 位點的 gRNA 表達。pCas-Guide-Scramble 質粒類似，但編碼的 gRNA 不靶向任何特定的基因組位點。pAAVS1-puroDNR 質粒包含左側和與 AAVS1 位點 CMV 增強劑和磷酸甘油酸激酶 1 啟動子 (pPGK) 的右同源臂，驅動嘌呤霉素抗性基因的表達。先前在 Ronald 實驗室構建的 LV pEF1a-tdT-P2A-Luc2 載體包含人延伸因子 la 啟動子 ( pEF1α) 驅動熒光 RGtdTomato (tdT) 和產生螢火蟲螢光素酶蛋白 (FLuc) 的密碼子優化的生物發光 RG 螢火蟲螢光素酶 (Luc2) 的表達。高效自切割豬 teschovirus-1 肽 (P2A)27. pEF1a-tdT-P2A-Luc2 盒通過 PCR 擴增并使用融合克隆 (Takara Bio, Mountain View, CA) 克隆到 pAAVS1-puroDNR 構建體中用 ApaI 和 FseI (New England Biolabs Inc, Ipswich MA) 消化 pAAVS1-puroDNR。這種新的供體載體被稱為 pAAVS1-puro pEF1α-tdT-P2A-Luc2-DNR。
細胞和細胞工程
人胚胎腎 (HEK293T;ATCC Manassas VA) 細胞維持在 Dulbecco 改良 Eagle 培養基 (Thermo Fisher OntarioCA) 中，該培養基含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/鏈霉素，37C 和 5% CO2。轉染前一天，將細胞接種在六孔中板，密度為每孔 7x10 個細胞。按照制造商的建議，用 Lipofectamine 3000 轉染細胞質粒或 pAAVS1-puro-pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR 和 pCas-Guide 打亂質粒各 0.5 ug，與 1 uL P3000 試劑、50 uL Opti-MEM 培養基和 0.75 uL Lipofect amine 3000 混合。轉染嘌呤霉素后 12 天將tibiotic(0.6ug / mL)添加到生長培養基中，并通過每天更換培養基來維持嘌呤霉素選擇7天。由此產生的嘌呤霉素抗性細胞群稱為我們的混合細胞群(MCP)。
AAVS1 整合分析
使用 DNeasy Blood and Tissue 試劑盒(QIAGEN Ontario, CA)從 MCP 中提取基因組 DNA(gDNA)。為了檢測 AAVS1 位點的整合，制作引物以 PCR 擴增同源外 AAVS1 基因組位點之間的 5 和 3 連接。為5'連接設計的PCR引物為：5-AGGCAGGTCC TGCTTTCTCTGAC-3(正向引物與AAVS1位點互補)和5-TGCCTGCTCTTTACTGAA GGCTC-3(與嘌呤霉素抗性基因互補)，潛在1.1 kb PCR 產物：對于 3iunction 是 5'-CCTGGAAGTTG CCACTCCAG-3(與供體盒中的 poly A 尾互補的正向引物)和 5-AAGGC AGCCTGGTAGACAGG-3'(與 AAVS1 位點互補的反向引物)，潛在 1.4kb PCR 產物。在確認 AAVS1 引導 MCP 包含正確編輯的細胞后，將 MCP 連續稀釋以在 96 孔板的每個孔中獲得單個細胞。在細胞擴增后，我們從每個克隆群體中分離出 DNA使用與 MCP 相同的 PCR 引物再次評估 QuickExtract DNA 提取溶液(EpicentreMadisonWand AAVS1 整合。使用 Nucleospin 凝膠和PCR 凈化試劑盒(Macherey NagelDuren Germany)和 PCR 產物在倫敦區域基因組學中心(Robarts Research Institute,London,ONCanada)進行測序。
報告基因功能
為了評估 tdTRG 功能，使用 EVOS FL aut 2 顯微鏡(Thermo Fisher Scientific)獲得熒光圖像。BLI 實驗一式三份進行并用于評估 Luc2 RG 功能 BLI 信號和細胞數之間的關系，以及不同細胞傳代中的 Luc2 RG 表達水平數字。為了評估 Luc2 RG 功能以及 BLI 信號和細胞編號之間的關系，將 HEK293T 細胞以每孔 1x1045x101x101.5x10 和 2.5x10 個細胞的濃度接種在 24 孔板中。為了評估增加細胞傳代數對 Luc2 RG 表達的影響，將 5x10 細胞接種在 81012 和 14 代的 24 孔板中。對于所有板的 BLI，將 5 μL D-熒光素(0.1 mg/mL Perkin Elmer，Waltham MA)添加到每口井在使用混合光學/X 射線掃描儀(IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System;PerkinElmer)收集圖像前 5 分鐘。使用 LivingImage 軟件(PerkinElmer)分析 BLI 信號以確定平均輻射亮度(p/s/cm/ sr) 每口井。
動物研究
以下協議是按照加拿大動物護理委員會和西方大學動物護理委員會關于實驗室動物護理和使用的指南進行的。本研究使用 6-8 周大的雌性 NUNUnude 小鼠 (NU-Foxn1n=5) ( Charles Rivers，Wilmington，MA)。每只小鼠在左后腹皮下注射 2.5x10Clone 10 HEK-293T 細胞。在第 037、14、21 天，在與上述相同的混合光學/X 射線掃描儀上進行 BLI，和28 只注射后的小鼠用 100% 氧氣中的 2% 異氟醚麻醉，使用連接到活性炭過濾器上的鼻錐。麻醉小鼠腹膜內注射 150uL D 熒光素 (30mg/mL) 并捕獲生物發光圖像長達45 分鐘。使用 LivingImage 軟件 (PerkinElmer) 分析 BLI 信號，并通過在植入部位上繪制感興趣區域來確定平均輻射 (p/sec/cm/sr)。45 分鐘成像期間的峰值平均輻射用于在每個成像時間點對每只小鼠進行量化。
組織學
在終點處，通過異氟醚過量處死小鼠，并從左后腹取出HEK293T生長組織。將組織固定在 4% 多聚甲醛中，然后在 30% 蔗糖的 PBS 中冷凍保存 24 小時。冷凍保存后，將組織浸入最佳切割溫度并使用液氮冷凍。使用 Leica CM350 低溫恒溫器系統(Leica BiosystemsWetzlarGer)進行冷凍切片許多)以獲得 14um 冷凍切片。冷凍切片用兔抗螢火蟲熒光素酶一抗(ab21176Abcam，Cambridge，UK)和山羊抗兔 Alexa Fluor 488 二抗(ab150077 Abcam)染色，以評估 FLuc 的存在或僅用山羊抗兔 alexa fluor 488 二抗作為 FLuc 存在的對照，以及用于定位細胞核的 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 使用 ZeissLSM800 共聚焦顯微鏡(ZeissOberkochenGermany)對切片進行成像。
統計數據
使用 GraphPad PRISM 7 軟件進行統計分析。為了比較接種的細胞數與體外 BLI 信號，我們進行了 Pearson 相關測試。為了評估體外 BLI 信號與傳代次數的差異，我們進行了 Tukey 的多重比較測試。為了評估體內 BLI 信號隨時間的差異，我們使用具有事后多重比較檢驗的弗里德曼檢驗。所有實驗的 p 值為 0.05 被認為具有統計學意義。
研究內容
1.使用 CRISPR/Cas9 多模態報告基因 (RG) 系統在 AAVS1 位點改造細胞
pAAVS1-puro-pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR質粒被開發用于與pCas Guide-AAVS1質粒結合使用，將多個成像RG(tdT和Luc2)整合到細胞的AAVS1安全基因組港中。pAAVS1-puro-pEF1a-tdTP2A-Luc2-DNR, pCas-guide-AAVS1, 和pCas-GuideScramble的質粒主要特點分別如圖 1A-C 所示。為在細胞的 AAVS1 位點實現 RG 表達而進行的基因組編輯步驟如圖 1D 所示。
為了確定 CRISPR/Cas9 系統是否可以有效地編輯具有大 RG 構建體(~6.3kb)的細胞的 AAVS1 位點，將 HEK293T 細胞與 pCas-Guide-AAVS1 和 pAAVS1-puro pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR 質粒共轉染或 pCas-Guide Scramble 和 pAAVS1-pur-pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR 質粒。正如預期的那樣，兩種轉染都產生了嘌呤霉素抗性細胞群，但我們使用 5' 基因組 - 供體盒連接處的引物進行的 PCR AAVS1 整合測試(圖 2A)揭示了僅在與 AAVS1 靶向 gRNA 共轉染的 MCP 中的條帶(圖 2B). 然后建立和擴了 26 個克隆細胞群，并使用 PCR 分析測試在 AAVS1 位點的整合。在測試的 26 個克隆中，只有第 10 個克隆群(HEK293T 克隆 10)顯示供體盒整合到AAVS1 位點使用引物組用于 3 和 5 基因組供體盒連接。因此正確編輯的嘌呤霉素抗性細胞百分比為 3.8%。PCR 產物的凝膠提取和測序揭示了預期的 DNA 序列，進一步驗證了 AAVS1 編輯在這個細胞群中使用我們的供體盒(圖 2D，E)。
在克隆群體中的 AAVS1 位點編輯確認后，進行體外實驗以確定整合的 RGs 是否在這些細胞中起作用。HEK293T 克隆 10 細胞的明場和熒光圖像顯示功能性 tdTex - 表達(圖 3A)。每孔不同數量的細胞(1x10、5x10、1x101.5x10 和 2.5x105)也用 BLI 成像以可視化 Luc2 表達(圖 3)。3B)，細胞數與BLI信號呈顯著正相關(p<0.05：r2=0.9988;圖3c)。隨著傳代數增加的細胞bli(pp10p12p14)bli信號無顯著差異(p>0.05，圖 3D)。
圖1. 腺相關病毒整合位點 1 (AAVS1) 靶向 CRISPR-Cas9 雙質粒系統和基因組編輯方案。(A) pAAVS1-puro-pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR (B) pCas-Guide-AAVS1 質粒和 (C) pCas-Guide-Scramble 質粒的矢量圖。(D) 用 CRISPR-Cas9 質粒轉染細胞，并在轉染后 12 天將嘌呤霉素抗生素添加到轉染群體中以進行細胞選擇。產生的混合細胞群 (MCP) 用結 PCR 進行評估，以驗證供體盒整合到一些細胞中的 AAVS1 位點。培養單克隆種群并評估成功的基因組編輯。成功編輯的克隆在體外成像以確定報告基因功能，并在體內成像以監測細胞隨時間的活力
圖2. 在 AAVS1 位點編輯的人胚腎 (HEK293T) 細胞的連接 PCR 分析。(A) 同源定向修復介導的供體盒插入后 AAVS1 位點的圖示，綠色箭頭代表 PCR 引物及其各自的產物大小，如下所示。(B) 混合細胞群 (MCP) 的 PCR 評估顯示 pCas-Guide-AAVS1 和 pAAVS1-puroDNRtdT-Fluc 質粒轉染群存在正確大小的單條帶。控制 MCP 中不存在條帶。(C) 單個克隆群體的 PCR 評估顯示第十個克隆群體(克隆 10)對于 5￠ 連接和 3￠ 連接 PCR 測試具有正確的條帶大小。沒有注意到幼稚 HEK293T 細胞的條帶。克隆 10 個 PCR 產物的測序顯示 AAVS1 位點和左同源臂 (LHA) (D) 之間的 5￠ 連接點和右同源臂 (RHA) 和 AAVS1 位點 (E) 之間的 3￠ 連接點, 進一步證實AAVS1 位點克隆 10 細胞群中的基因組編輯
圖3. 報告基因功能的體外研究。(A) 明場圖像和熒光顯微鏡圖像顯示 HEK293T 克隆 10 細胞中的 tdTomato 表達。(B) 增加 HEK293T 克隆 10 細胞數量的生物發光成像 (BLI) 顯示螢火蟲熒光素酶 (FLuc) 表達。(C) 發現細胞數和 BLI 信號之間存在顯著的線性相關性。p < 0.05; R2 = 0.9988。(D) HEK293T 克隆 10 細胞在體外多次傳代中 FLuc 表達沒有顯著變化。p > 0.05。
2. AAVS1 編輯細胞的縱向體內 RG 成像
接下來，我們進行了體內 BLI，以評估 AAVS1 編輯的細胞的生存能力超時。將 HEK293Tclone10 細胞 (2.5x10°) 注射到裸鼠的左后腹，并在注射后第0，3，7，14，21，和28 天進行 BLI。到第 7 天，在五只小鼠中的一只中觀察到 BLI 信號的喪失(代表活細胞的喪失)，因此該小鼠被排除在其余的成像時間點之外。在其余四只小鼠的所有時間點獲得的每個 BLI 圖像中都可以檢測到信號。圖 4A 顯示了隨著時間的推移為一只小鼠采集的代表性圖像。從第 0 天到第 7 天觀察到 BLI 信號下降，這可能是由于細胞死亡，隨后隨著細胞在后側形成團塊而 BLI 信號增加。這種趨勢在所有四只小鼠的信號丟失和復發是一致的，所有四只小鼠的平均 BLI 信號從第 7 天到第 28 天顯著增加(p<0.05;圖 4B)。
圖4. 隨著時間的推移，AAVS1 編輯的細胞的體內 BLI。(A) 將表達 FLuc 的 AAVS1 編輯的 HEK293T 細胞(克隆 10)的 BLI 植入代表性小鼠的左后腹，在植入后第 0、3、7、14、21 和 28 天成像。在前 7 天觀察到 BLI 信號的初始下降，隨后 BLI 信號增加。(B) 隨著時間的推移，每幅圖像中平均輻射的量化顯示，從第 7 天到第 28 天，BLI 信號顯著增加(p < 0.05;n = 4 只小鼠)。
3. 組織學
為了確認 HEK293T 克隆 10 生長組織具有 Luc2 RG 表達，對冰凍切片進行染色以確認螢火蟲熒光素酶蛋白 (FLuc) 的存在。熒光圖像顯示染色的 HEK293T 克隆 10 生長組織中的 FLuc(圖 5A)與對照 HEK293T 克隆 10 生長相比組織(圖 5B)。
圖5. HEK293T 生長組織的代表性圖像顯示 FLuc 染色陽性 (A)，僅在二次染色的切片中不存在 (B)。底行 (C, D) 顯示相同部分的 DAPI 染色
結論與討論
基于報告基因的體內細胞追蹤是癌癥進展和癌癥治療等疾病的臨床前研究以及基于細胞的療法的功效的一種有價值的工具，因為它可以提供有關位置、分布和生存能力的信息。
然而，這種方法被潛在的生物學和在考慮翻譯時由于在隨機基因組位點穩定整合 RGs 引起的安全問題所混淆。例如，之前的研究表明，與臨床前研究中的非工程細胞相比，病毒介導的工程細胞可以改變行為。這也產生了深遠的臨床后果，如四名患有 x 連鎖嚴重聯合免疫缺陷病的患者在注射逆轉錄病毒工程 CD34+ 細胞后患上白血病并死亡33。潛在的行為改變和傳統細胞工程技術的整體安全性的不確定性表明，需要一種更安全、更有效的方法來對細胞群進行基因標記，以跟蹤、治療或靶向疾病。我們探索了使用 CRISPR/Cas9 技術對 AAVS1 安全基因組位點的細胞進行基因改造，以實現細胞活力隨時間推移的體內 RG 成像。作為原理證明，我們證明了我們的雙質粒 AAVS1 靶向 CRISPR/Cas9 系統可用于在具有多個 RG(即 tdT 和 Luc2)的 AAVS1 基因座處對細胞進行基因編輯，編碼的 RG 具有功能性和穩定性，并且 可以使用非侵入性 BLI 在小鼠中隨時間監測工程細胞的活力。
CRISPR/Cas9 于 2013被報道為基因組編輯工具，此后被廣泛用作轉基因敲入研究的相對簡單且有效的技術，此外，非成像研究已使用 CRISPR/Cas9 系統在 AAVS1 基因座處整合各種轉基因。盡管其他基因組編輯技術已經存在了一段時間(例如 ZFNs 和 TALENs，但 CRISPR 的改進效率經常被討論與這些工具相關，據報道，“敲入"效率從 0.14% 到 66%，具體取決于人類細胞類型以及用于引入 Cas9 基因/mRNA/蛋白質 gRNA 和供體盒的方法。敲入的一個考慮因素是較大的插入盒會導致編輯效率下降。出于我們的目的，這對在質粒構建過程中可以使用的 RG 數量和大小，然而，由于 CRISPR/Cas9 系統已被證明能夠將大型 RG 構建體插入特定基因組位點，我們設計了我們的供體質粒來編碼兩個成像 RG，這些 RG 通過使用 2A 肽以及抗生素選擇標記由單個啟動子驅動。在這項工作中，3.8% 的嘌呤霉素抗性 HEK-293T 細胞被正確編輯。與之前使用 CRISPR Cas9 編輯 AAVS1 位點的基因組編輯研究相比，這是相對較低的效率。但是對于我們構建的大小，這是可以預料的.據我們所知，我們是第一個報告大型雙 RG 表達盒(~6.3kb)可以在 AAVSI 站點與 CRISPR/Cas9 技術集成的報告。在目前的研究中，tdT RG 允許我們進行熒光顯微鏡檢查，但未來我們可能會通過去除嘌呤霉素抗性基因并使用 tdT 表達來進行熒光激活細胞分選和擴大工程細胞群來限制我們構建體的大小。更高代數的細胞已被證明過去已經改變了基因表達。我們的實驗依賴于隨著時間推移穩定的 RG 表達，以準確檢測細胞并比較細胞增殖隨著時間的推移。因此，我們測試了隨著傳代次數增加的細胞群中 RG 表達的變化，但沒有發現任何顯著差異。重要的是，RGs 使我們能夠使用基于 FLuc 的 BLI，使我們能夠在細胞注射后直接可視化工程細胞群并評估 由于 FLuc 需要 ATP 作為光產生的輔助因子，因此隨著時間的推移細胞的活力。BLI 還能夠在一只小鼠的早期時間點快速且相對便宜地篩查異種移植排斥，從而使我們能夠將這種動物排除在研究的其余部分之外。該系統目前僅限于臨床前研究，可以很容易地對其進行修改，以表達臨床成像模式(如磁共振成像正電子發射斷層掃描 (PET) 或光聲斷層掃描)感興趣的替代 RG。
我們的 CRISPR/Cas9 方法并非沒有限制，需要在未來的研究中解決。首先，與慢病毒系統相比，CRISPR/Cas9 質粒系統的整合效率要低得多。我們使用相對較大的供體構建體(10.6 kb 總質粒大小和 6.3 kb 預期插入)很可能降低了我們系統的效率，因為更大的插入更難敲入以及低于理想的轉染效率。未來的工作應該著眼于減少供體盒的大小和整體質粒大小(例如, 通過限制 RGs 的數量)來提高轉染效率和隨后的編輯效率 在對陽離子轉染劑特別是原代細胞具有抗性的細胞中，使用物理基因轉移方法(例如微孔/核轉染/磁轉染)也可以提高轉染效率。或者，也可以探索使用附加型病毒載體。例如腺相關病毒或非整合慢病毒載體，以將所有必要的成分遞送到細胞中。還有研究表明，用 Cas9-gRNA 核糖核蛋白復合物轉染細胞可以提高切割效率，從而提高敲入效率。56-58另一個考慮因素是基因組無論是通過 CRISPR Cas9 脫靶切割還是正常的質粒整合，編輯方法都不能消除隨機整合事件。Fu 等人表明，精心設計的 agRNA 可以減少脫靶效應，而 CRISPR 酶上的新 Cas9 類似物已減少脫靶效應正在開發中。6061 此外，Chen 等人也證明了這一點。抗生素選擇有助于更多數量的脫靶效應。通過實施熒光激活細胞分選，如 Raul Bressen 等人所示。嘌呤霉素選擇可以從協議中刪除，從而實現更有效的選擇過程和更少的隨機整合事件。我們方法的另一個限制是必須將集成在 AAVS1 站點的細胞與那些包含隨機集成盒的細胞分開。測試使用 CRISPR/Cas9 系統所需的單個克隆群體的過程更加費力，并且可以減少原始細胞群體的自然細胞異質性。盡管此處未進行，但可以將多個克隆細胞群匯集在一起，以減輕細胞異質性的損失，但僅選擇那些已正確編輯的細胞的新方法將是非常有價值的。通過實施其中一些或許多方法，我們計劃繼續改進我們的 CRISPR/Cas9 遞送系統。我們認為，通過這些改進，該系統將成為廣泛適用和高度有用的技術，用于廣泛的癌癥和基于細胞的治療分子遺傳成像在臨床前和潛在的臨床研究中。
結論
這項工作描述了雙質粒系統的開發，以通過分子成像 RGs 對細胞進行 AAVS1 靶向 CRISPR/Cas9 基因組編輯。我們能夠證明 CRISPR/Cas9 系統可用于執行大型整合 構建編碼抗生素選擇標記和多個 RGs 到 AAVS1 安全港，以實現基于體內 RG 的縱向細胞追蹤 可以很容易地在培養中擴增(例如，T細胞)。通過這些改進，這種基因組編輯系統將在未來基于 RG 的體內細胞追蹤研究中廣泛使用。
3
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務