今天推薦的是由上海交通大學醫學院在2021年2月4日發表于Nature Communications（2021IF：17.6939，JCRQ1）的一篇文章，通訊研究人員是Ying-Li Wu教授，研究表明靶向USP47克服了酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性并除慢性骨髓性白血病的白血病干細胞。治療慢性骨髓性白血病（CML）需要確定新的藥物靶點，以克服對酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的耐藥性，并除白血病干/祖細胞。研究人員表明泛素特異性肽酶47（USP47）是克服TKI抗性的一個潛在靶標。分析顯示，USP47的敲低抑制了體外和體內對伊馬替尼敏感或耐藥的CML細胞的增殖。敲低Usp47可明顯抑制BCR-ABL和BCR-ABLT315I誘導的小鼠CML，Lin-Sca1+c-Kit+CML干細胞的減少。機制研究表明，穩定Y-box結合蛋白1有助于USP47在CML細胞中介導的DNA損傷修復。通過P22077抑制USP47，在體外和體內對具有或不具有TKI抗性的CML細胞發揮細胞毒性。此外，P22077可消除CML小鼠的白血病干/祖細胞。總之，靶向USP47是克服TKI耐藥性和除CML中白血病干細胞的一種有希望的策略。
圖1.文章研究思路
為了篩選出參與CML發病機制的潛在DUBs，研究人員比較了原發性CML細胞（慢性期，n=5）和正常骨髓（BM）CD34+細胞（n=3）中DUBs的表達。與正常骨髓CD34+細胞相比，一些DUBs包括USP47、USP9X、USP14、OTUB2等在CML細胞中的表達水平較高，其中USP47是上調最多的一個。與此結果一致，在疾病進展的不同階段，USP47蛋白水平在原發性CML細胞中明顯上調。接下來，研究人員確定USP47是否受BCR-ABL的調節。與對照組的細胞相比，在BCR-ABL轉染的骨髓祖細胞32D（32DBCR-ABL）中，USP47的mRNA和蛋白水平的表達都明顯上調了。相反，BCR-ABL敲低或IM處理會減弱USP47在mRNA和蛋白水平的表達。另一方面，在抑制RAS或ERK和STAT5沉寂后，USP47的表達也減弱了。BCR-ABL誘導的USP47的上調是由RAS/ERK和STAT5信號通路的激活所介導的。
圖2.BCR-ABL通過RAS/ERK和STAT5途徑調控CML中的USP47為了進一步探討USP47在CML中的作用，建立了Usp47敲低小鼠模型（Usp47-/-）（圖3a）。與Usp47+/+小鼠相比，BM細胞總數、白細胞總數、紅細胞、粒細胞、淋巴細胞和血小板的數量與Usp47-/-小鼠相當（圖3b）。Usp47-/-和Usp47+/+小鼠的造血系統也相似。此外，Usp47+/+和Usp47-/-小鼠的骨髓Lin-Sca1+c-kit+（LSK）細胞的百分比也是相當的，這些細胞是BCRABL的靶細胞（圖3c）。然而，接受BCR-ABL轉化的Usp47-/-BM細胞的小鼠生存時間明顯長于接受BCR-ABL轉化的Usp47+/+細胞的小鼠。此外，Usp47+/+小鼠的脾臟大小和重量都比Usp47-/-小鼠明顯增加。流式細胞儀分析顯示，與Usp47+/+組相比，Usp47-/-組BM中GFP+Gr-1+細胞的百分比明顯降低（圖3f）。一致的是，在Usp47-/-組的PB中檢測到更少的CML白血病細胞。另外，Usp47+/+組的肝臟和脾臟組織比Usp47-/-組受損更嚴重。在Usp47+/+小鼠的肝臟和脾臟中發現大量的CML白血病細胞（GFP陽性細胞）浸潤。此外，與Usp47+/+組相比，Usp47-/-組的CML白血病干/祖細胞（GFP+LSK細胞）的數量明顯減少。USP47在BCR-ABL誘導的CML的發病機制中起著重要作用。
圖3.敲低Usp47可抑制BCR-ABL誘導的小鼠CML的發展研究人員探討了USP47在CML中發揮作用的機制。盡管有報道說MAPK或β-catenin在果蠅或腫瘤中與USP47相互作用，但USP47敲低并不影響CML細胞中MAPK或β-catenin的表達。然后，研究人員通過免疫沉淀、分離并使用質譜分析了USP47相互作用的蛋白。結果發現，YB-1在K562和原發性CML細胞中能與USP47相互作用。為了繪制YB-1與USP47的相互作用域，構建了截斷形式的YB-1并與USP47共同轉染到HEK293T細胞。結果顯示，USP47與YB-1的C端結構域（CTD）相互作用。研究人員進一步研究USP47是否調節YB-1的泛素化。如圖5d所示，USP47的過量表達明顯抑制了全長的YB-1和YB-1-S3的泛素化，但沒有抑制截短的YB-1-S2的泛素化，后者不能結合USP47。與USP47對YB-1的去泛素化作用相一致，在原發性CML細胞中觀察到的泛素化YB-1比正常BM細胞中的少。YB-1和USP47之間的相互作用不受YB-1泛素化狀態的影響，因為賴氨酸殘基（Lys137、164和170）的突變會抑制YB-1的泛素化，但不會抑制它與USP47的相互作用。研究人員隨后探究了USP47是否影響YB-1的穩定性，發現USP47的瞬轉延長了YB-1在K562細胞的半衰期。相反，USP47敲低或P22077處理會降低YB-1的半衰期。在Usp47敲低的MEF細胞中，YB-1的半衰期也會降低。USP47敲低誘導的YB-1蛋白的下調可以通過蛋白酶體抑制劑MG132的預處理而得到回補。同時，敲低USP47對YB-1或POLB的mRNA水平沒有影響，YB-1的mRNA表達在正常和CML細胞中相似，表明原發性CML細胞中YB-1蛋白水平的增加主要歸因于YB-1的轉錄后調節。此外，在重新引入Usp47后，YB-1的表達在Usp47-/-MEFs中得以恢復。這些發現表明，YB-1是USP47的一個新底物。
圖4.USP47與YB-1相互作用，保護其免受蛋白體降解的影響P22077是USP7/USP47的雙重抑制劑，被用來評估USP47在CML細胞系和初級CML細胞中的功能。如圖所示，P22077對正常PB的單核細胞表現出低毒性，而相反，P22077以劑量依賴的方式抑制IM敏感和IM抗性CML細胞系和原代CML細胞的增殖。值得注意的是，P22077對來自對第二代TKIs耐藥的CML患者的BM單核細胞顯示出明顯的細胞毒性。在原發性IM敏感和IM耐藥的CML細胞中，P22077處理減少了YB-1，但增加了γH2AX的表達以及caspase-3和PARP1的裂解，表明凋亡的激活。此外，USP47與原發性CML細胞中YB-1的表達呈正相關，USP47水平較高的CML細胞比USP47水平較低的細胞對P22077處理更敏感。然后研究人員用B-NDG小鼠CML模型評估了P22077對KBM5T315I細胞的影響。通過尾靜脈注射KBM5T315I細胞的B-NDG小鼠被分為四組，分別用藥物、IM、P22077和P22077加伊馬替尼治療。P22077明顯延長了CML小鼠的生存期，而P22077聯合IM對P22077無明顯增強作用。更重要的是，利用從一名TKI耐藥的CML患者建立的CML患者源性異種移植模型，研究人員發現P22077治療可以明顯延長小鼠的生存期，并降低二次骨髓移植中CD34+CD38-的百分比。鑒于USP47在CML干/祖細胞中的重要作用，研究人員研究了P22077對初級CD34+CML細胞的影響。P22077對正常的CD34+細胞不產生細胞毒性，但明顯抑制來自新生和IM抗性CML患者的CD34+細胞的集落形成活性。此外，在BCR-ABL誘導的CML小鼠模型中，P22077明顯減少了CML干/祖細胞的數量。在MRD小鼠模型中，P22077治療可顯著消除CMLGFP+LSKs的數量。P22077對CML細胞，包括CML干/祖細胞明顯地發揮了細胞毒性。
圖5.P22077在體外和體內對CML細胞和CML白血病干細胞顯示出顯著的毒性
TKI抗性和CML白血病干細胞仍然是治療BCR-ABL+CML的主要挑戰。在這項研究中，研究人員證明USP47在體外和體內對TKI敏感、TKI耐藥和CML干/祖細胞的增殖中起著關鍵作用。作為USP47的底物，YB-1有助于USP47介導的CML細胞的DNA損傷修復。因此，靶向USP47是克服TKI耐藥性和除CML干/祖細胞的一個有希望的策略。
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