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賽默飛 TRIzol 試劑是一種即用型試劑,該和 Guanidine isothiocyanate 的單相溶液設計用于在1小時內從人類、動物、植物、酵母或細菌來源的細胞和組織樣本中提取高質量的總RNA(以及DNA和蛋白質),TRIzol試劑在樣本勻漿化時,可以破壞細胞,溶解細胞組分,同時高效的抑制RNA酶的活性,從而維持RNA的完整性。
TRIzol™ 試劑的主要特點包括:
? 可從同一樣品中分離 RNA、DNA 和蛋白
? 擁有的裂解能力,甚至可處理困難的樣品類型(CN)2
? 針對組織、細胞、血清、病毒和細菌進行優化的配方和方案
從多種樣品體積和來源中可靠純化 RNA
TRIzol™ 試劑可很好地處理少量組織 (50–100 mg) 和細胞 (5 × 106) 以及大量組織 (≥1 g) 和細胞 (>107),且包含用于從人、動物、植物或細菌來源的樣品中進行純化的方案。TRIzol™ 試劑通過在樣品均質化期間高效抑制 RNase 活性維持 RNA 的完整性,同時破壞細胞并溶解細胞組分。TRIzol™ 試劑方法的簡單性使其可同時處理大量樣品??稍诓坏?1 小時的時間內完成整個程序。通過 TRIzol™ 試劑分離的總 RNA 不含蛋白和 DNA 污染。
其配方可分離多種分子靶標
TRIzol™ 試劑可使您連續沉淀單份樣品中的 RNA、DNA 和蛋白。使用 TRIzol™ 試劑均質化樣品后,加入氯仿,使勻漿分離成透明的上層水層(含 RNA)、中間相和紅色下層有機層(含 DNA 和蛋白)。使用異丙醇從水層中沉淀出 RNA。使用乙醇從中間相/有機層中沉淀出 DNA。通過異丙醇沉淀從-乙醇上清液中沉淀出蛋白。將沉淀出的 RNA、DNA 或蛋白洗滌以去除雜質,然后重懸以用于下游應用。
TRIzol 使用必學小妙招
準備階段:
1. 確保實驗環境無核酸酶污染,可以使用 RNaseZap™ RNase 去污溶液(貨號 AM9780)去除實驗臺表面和非一次性物品。
2. 實驗過程中,請使用一次性手套和不含核酸酶的一次性槍頭和離心管,防止引入核酸酶污染。
3. 準備好相應的實驗材料:
a. 提取 RNA:異丙醇,乙醇(75%),0.5% SDS 溶液。
b. 提取 DNA:乙醇(99%),乙醇(75%),0.1 M檸檬酸鈉溶于 10% 乙醇,8 mM NaOH,HEPES。
c. 提取蛋白質:異丙醇,乙醇(99%),含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇,1% SDS 溶液。
tips
實驗環境和實驗用品的核酸酶污染是導致 RNA 實驗失敗的重要因素,做好核酸酶清除工作,使用無核酸酶的實驗用品,可以讓我們實驗事半功倍哦!
實驗步驟:
裂解樣本
1. 根據不同樣本材料在 TRIzol 試劑中裂解并勻漿化樣本。
a. 組織:每 50~100 mg 組織加入 1 mL TRIzol 試劑,用勻漿儀對樣本進行勻漿化。
b. 單層培養細胞:移除培養基,每 1×105~107個細胞加入 0.3~0.4 mL TRIzol 試劑,反復吹打勻漿化樣本。
c. 細胞懸液:離心后棄除上清液,收集細胞,每 0.25 mL 樣本加 0.75 mL 的 TRIzol 試劑,反復吹打以勻漿化。
tips
1)在 TRIzol 試劑中可以防止 RNA 降解,故加入 TRIzol 試劑前,不要洗滌細胞。
2)樣本體積不應超過用于裂解的 TRIzol 試劑體積的 10%。
2. 孵育 5 分鐘,隨后每 1 mL TRIzol 試劑添加 0.2 mL 氯仿,蓋緊蓋子,劇烈混勻。孵育 2~3 分鐘。4℃ 下 12,000×g 離心 15 分鐘。
3. 此時混合物分離成為三層,如下圖,我們需要將對應提取部分吸出進行后續操作。
tips
Invitrogen™ Phasemaker 分層管(貨號:A33248,A33249)可在 TRIzol 混合物樣品的水相和有機相間形成一層牢固可靠的膠封,使科研人員能夠輕松移取 RNA 相。
RNA 提取
1. RNA 沉淀:取盡上層水相,每 1 mL TRIzol 試劑加 0.5 mL 異丙醇。4℃ 孵育10分鐘。4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘。此時底部的白色膠狀沉淀即為總 RNA 沉淀。棄上清液。
2. RNA 洗滌:每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑,用 1 mL 75% 乙醇重懸沉淀。瞬時漩渦震蕩,在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘。棄上清,RNA 沉淀在空氣中干燥 5~10 分鐘。
3. RNA 溶解:用 20~50 μL 不含 RNase 的水,0.1 mM EDTA 或 0.5% SDS 溶液,反復吹打重懸沉淀。在 55~60℃ 孵育 10~15 分鐘,然后繼續下游實驗或者 -70℃ 長期保存。
tips
1)如果起始樣本很小(< 106 個細胞或 < 10 mg 組織),請將 5~10 μg 不含 RNase 的糖原作為載體加入到水相中,這樣有助于促進 RNA 沉淀。
2)如果 RNA 會在隨后的酶促反應中使用,則切勿將 RNA 溶解在 0.5% SDS 溶液中。
DNA 提取
1. DNA 沉淀:棄除上層水相,剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇,蓋緊管蓋,反復顛倒混勻。孵育 2~3 分鐘。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘,沉淀 DNA,移除溶有蛋白質的上清液。
2. DNA 洗滌:每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1 mL 含 10% 乙醇的 0.1 M 檸檬酸鈉(pH 8.5)重懸沉淀。孵育 30 分鐘,偶爾輕輕顛倒混合。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘,棄上清液。重復洗滌步驟一次。對于 DNA 含量較大的樣本(> 200 μg)可以重復洗滌步驟兩次。每 1 mL 用于裂解的TRIzol試劑加入 1.5~2 mL 75% 乙醇重懸沉淀,孵育 10~20 分鐘,偶爾輕輕顛倒混合。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘,棄上清液,沉淀風干 5~10 分鐘。
3. DNA 溶解:用 0.3~0.6 mL 的 8 mM NaOH 上下吹打重懸沉淀,4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘,轉移上清至新管子中。加 HEPES 調整 PH 用于下游應用或用 HEPES 和 1 mM EDTA 調節 PH 至 7~8 長期存儲于 -20℃。
tips
干燥 DNA 的時候,不要用真空離心干燥,會影響 DNA 質量以及后續 DNA 溶解。
蛋白質提取
1. 蛋白質沉淀:棄除上層水相,剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇,蓋緊管蓋,反復顛倒混勻。孵育 2~3 分鐘。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘,沉淀 DNA。上清轉移至新管中,每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1.5 mL 異丙醇,孵育 10 分鐘。在 4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘,棄上清液,留蛋白質沉淀。
2. 蛋白質洗滌:每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑需要加 2 mL 的含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇至沉淀中,孵育 20 分鐘。在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘。棄上清液,沉淀在干燥空氣中靜置 5~10 分鐘。
3. 蛋白質溶解:加入 200 μL 1% SDS 溶液,反復吹打重懸。4℃ 下 10,000×g 離心 10 分鐘,將上清轉移到新管中。檢測蛋白質濃度并用于下游應用或者長期存儲與 -20℃ 中。
tips
蛋白質溶解步驟中的重懸,在 50℃ 水浴或者金屬浴中孵育,有助于沉淀重懸充分。