微塑料正成為一個(gè)重大的全球環(huán)境問題。定期、有新聞價(jià)值的重大研究揭示，塑料和微塑料存在于偏遠(yuǎn)的地理位置，或作為污染物存在于不同消費(fèi)品（特別是食品和飲料）中以及海洋生物消化系統(tǒng)內(nèi)。微塑料的來源可能是初生微塑料，即專門設(shè)計(jì)或制造成小尺寸的材料，或者從較大材料開始但在環(huán)境中分解成較小碎片的次生微塑料。最初，微塑料經(jīng)定義為尺寸小于5mm的塑料材料，但是，盡管尚未有全球公認(rèn)的定義，但該定義現(xiàn)在更普遍地表述為尺寸處于1mm且小至微米水平范圍內(nèi)的塑料顆粒。
環(huán)境中大量的塑料污染是一個(gè)看得見的重大問題，亟待解決。小尺寸的微塑料人眼并不能看到，但它對(duì)水生和海洋物種的健康有著重要影響，并且最終可能會(huì)進(jìn)入人類食物鏈。
分析含有微塑料的環(huán)境樣品對(duì)確定其普遍性及其影響至關(guān)重要。一系列的分析技術(shù)已應(yīng)用于微塑料的分析。在所采用的技術(shù)中，紅外（IR）光譜分析，更具體而言是紅外顯微鏡，是檢測(cè)和鑒別微塑料的主要分析技術(shù)。
01
紅外顯微鏡的微塑料分析操作流程
從原始樣品到最終結(jié)果有幾個(gè)步驟，包括采集樣品到數(shù)據(jù)分析。所涉及的步驟可能會(huì)有所不同，這取決于樣品類型和紅外（IR）分析制備樣品所需的樣品凈化量。工作流程如表1所示。
表1.微塑料分析操作流程所涉及的步驟
不同來源的樣品和不同類型的樣品都需要對(duì)其微塑料的含量進(jìn)行分析。不同的樣品在采集和凈化方面均有其自身的復(fù)雜性。例如，瓶裝水中微塑料的分析無需對(duì)樣品凈化，而只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的過濾即可分析。而污水或動(dòng)物攝入的微塑料則需花費(fèi)幾天時(shí)間去凈化樣品，消解其他有機(jī)材料，從而對(duì)微塑料進(jìn)行“潔凈”分析。
02
樣品采集
以下對(duì)不同來源的樣品所采取的采樣策略做簡(jiǎn)要概述。
水采樣
小溪、河流到湖泊、遠(yuǎn)海等多種不同水環(huán)境含有微塑料。此外，據(jù)悉來自水處理廠的水也含有微塑料。采樣要求之間存在相似之處，因?yàn)橐杉枇椒秶鷥?nèi)的所有微塑料，并且了解水樣的體積也非常重要。采用一致的采樣策略，可確定微塑料的數(shù)量和/或質(zhì)量隨著時(shí)間推移呈增加還是減少趨勢(shì)。
樣品采集對(duì)海水和淡水具有不同的要求，這主要是因?yàn)樗芏炔煌４蠖鄶?shù)合成高分子材料的密度低于海水，這意味著微塑料一般漂浮在水面上，但是許多高分子類型材料都會(huì)沉沒在淡水系統(tǒng)中。用于采集海水表面樣品的典型設(shè)備是一個(gè)拖于船后的已知網(wǎng)目尺寸的曼塔拖網(wǎng)。對(duì)于水層面下的樣品，則采用合適的浮游生物采集網(wǎng)。這種方法也適用于湖泊和水灣。網(wǎng)目尺寸是一個(gè)重要的參數(shù)，因?yàn)樘〉木W(wǎng)目會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)在樣品采集過程中受到相當(dāng)快的阻塞。樣品采集的體積和面積可通過使用流量計(jì)以及根據(jù)網(wǎng)的入口尺寸和采集過程中移動(dòng)的距離得以確定。為測(cè)試河流水，通常將網(wǎng)懸掛于河流中的一個(gè)固定點(diǎn)，并且網(wǎng)的位置可得到設(shè)置或調(diào)整，以便在水面上或水面下的固定深度進(jìn)行采集。
沉積物采樣
在許多情況下，可在沉積物樣品（例如在海灘或河岸上）的表面上觀察到（微）塑料。在這種情況下，在分析前可易于對(duì)樣品進(jìn)行提取和清理。但是，微塑料存在于沉積物的更深層處，因此需要采用一種采樣策略。通常采集已知質(zhì)量或體積的沉積物，并確定每單位體積顆粒的質(zhì)量或數(shù)量。沉積物樣品可采集自海床、湖泊或河床，或者在潮汐或河流水位降低時(shí)采集自海灘或河岸。沉積物樣品需要進(jìn)一步的樣品凈化以便提取微塑料用于分析，下文將對(duì)該過程做介紹。
動(dòng)物攝入的塑料采樣
據(jù)悉，塑料和微塑料存在于多種海鳥和海洋生物的胃中，且通常會(huì)導(dǎo)致死亡。1 較大的塑料材料可從生物的解剖胃中物理提取而得，其在分析前需進(jìn)行清理。為確定包括微塑料在內(nèi)的塑料總量，有必要在分析前通過消解完全去除生物材料。下文將對(duì)消解的各種方法作討論。消解過程會(huì)留下塑料材料并且有望去除所有其他材料。
家用品和日用消費(fèi)品采樣
在家庭中有幾種微塑料被釋放到排水系統(tǒng)中。洗衣機(jī)在清洗的過程中會(huì)產(chǎn)生成千上萬(wàn)的纖維。2 此外，盡管根據(jù)不同國(guó)家和地區(qū)的立法，塑料微珠的使用正在逐步淘汰，但是許多日用消費(fèi)品和化妝品（例如牙膏和沐浴露）均含有塑料微珠成分。來自家用品的微塑料的采樣可通過在洗衣機(jī)的出水口或排水系統(tǒng)的出水口上安裝具有合適網(wǎng)目尺寸的篩網(wǎng)得以完成。就去角質(zhì)劑和身體磨砂膏而言，其大多數(shù)成分具有水溶性，因此在過濾前，將樣品與開水混合通常能去除微塑料之外的所有物質(zhì)。3
03
樣品凈化
為從紅外顯微鏡分析中獲得最佳結(jié)果，必須確保樣品潔凈且無任何干擾物質(zhì)（例如生物基質(zhì)）。以下是紅外分析前用于樣品凈化所采用的不同方法的簡(jiǎn)要概述。
密度分離法（漂浮）
塑料具有多種密度范圍，因此一些塑料會(huì)漂浮在淡水或海水中，而另一些則會(huì)沉沒。這種漂浮原理可用于將塑料材料與密度通常較高的其他物質(zhì)（例如沉積物）分離。通過將樣品與（密度較高的）飽和鹽溶液混合，可擴(kuò)大漂浮的塑料材料的范圍，并且可從液體的上層部分去除塑料。
塑料的密度范圍大約從0.9g/cm3（聚丙烯（PP）和低密度聚乙烯（LDPE））至1.4g/cm3（聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚氯乙烯（PVC））不等。4
因此對(duì)于典型密度為1-1.05g/cm3的淡水或海水樣品，PP和LDPE將通過漂浮從密度顯著較高的沙子或沉積物中分離出來。
已采用一系列將溶液密度最大化的飽和鹽溶液，以便使更多種范圍的塑料材料得以漂浮。5,6,7采用了密度為1.2-1.8g/cm3的氯化鈉、溴化物和碘化物以及密度為1.7g/cm3的氯化鋅。
分離過程包括攪拌樣品，通常是沉淀物樣品，并使溶液沉降。然后取溶液的上清液過濾后分析。
樣品消解
樣品消解的目的是去除會(huì)干擾微塑料分析但不會(huì)影響微塑料本身的生物、無機(jī)或有機(jī)材料。根據(jù)樣品基質(zhì)，可采用一系列不同的樣品消解技術(shù)。用于消解的材料可具有酸性、堿性、氧化性或酶促性。8,9,10對(duì)于酸性消解，采用的是熱硝酸，但是這將導(dǎo)致一些高分子類型材料降解。10%的氫氧化鉀溶液已作為基底物。經(jīng)證明，處于30-40%范圍內(nèi)的過氧化氫溶液具有有效性。但是，消解可能較緩慢，其需要耗費(fèi)幾天時(shí)間才可完成。采用蛋白酶K作為酶消解具有有效性。這種處理速度顯著加快，并且在50℃下兩小時(shí)的消解可從樣品中去除大量生物材料并且不會(huì)降解塑料本身。
過濾
在一些樣品類型中，過濾是指從樣品基質(zhì)中分離出所需的微塑料（例如瓶裝水中微塑料的采集和測(cè)量）。在許多情況下，過濾是樣品凈化過程后的附加步驟。過濾過程需要符合分析的要求，并且可用作樣品凈化步驟。使用不同網(wǎng)目尺寸的篩網(wǎng)可以將塑料收集調(diào)整到分析技術(shù)所需的樣品尺寸大小。例如，最初采用大的網(wǎng)目尺寸可過濾掉存在的較大塑料或者可去除其他較大的碎片，以便防止過濾器堵塞。微塑料可受到較小網(wǎng)目尺寸的篩網(wǎng)或?yàn)V膜的截留。采用標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜儀易于分析較大的塑料。但是，紅外顯微鏡更常用于微塑料的分析。在某些情況下，對(duì)篩網(wǎng)上采集的微塑料所作的紅外顯微鏡分析可直接在篩網(wǎng)上進(jìn)行。3過濾過程的優(yōu)化將在后面進(jìn)行描述。
04
用于紅外分析的樣品制備
紅外光譜分析是識(shí)別和鑒定高分子材料的主要分析技術(shù)。材料的紅外光譜為該材料提供的“指紋”，并且可與大量的光譜庫(kù)作比較以進(jìn)行正確識(shí)別。采用標(biāo)準(zhǔn)的紅外光譜儀器和衰減全反射（ATR）采樣技術(shù)易于測(cè)量尺寸不小于100微米左右的微塑料纖維和顆粒。小型便攜式紅外光譜儀器（圖1）可攜帶至船上，以便立即識(shí)別采集的樣品。11
圖1. 具有ATR采樣模塊的Spectrum Two紅外光譜儀
對(duì)于利用ATR進(jìn)行測(cè)量的較大樣品，通常無需樣品制備。將樣品直接置于ATR附件上，采用壓力臂施加壓力并掃描樣品。但是，應(yīng)注意的是，在環(huán)境中存在了相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的塑料已風(fēng)化，并且其表面可能覆有生物膜。ATR是一種表面技術(shù)。因此，在這種情況下，建議將塑料樣品切片并測(cè)量樣品的內(nèi)部體積而非受損/受包覆表面。
紅外顯微鏡或紅外成像系統(tǒng)可用于測(cè)量更小的顆粒。為從此類技術(shù)中獲得最佳結(jié)果，必須將微塑料從樣品基質(zhì)中分離出來。上述樣品采集和樣品凈化的介紹中已對(duì)該方法作出討論。但是，具體操作步驟可針對(duì)紅外顯微鏡進(jìn)行優(yōu)化。
05
優(yōu)化紅外顯微鏡分析的過濾過程
樣品過濾會(huì)將微塑料分離至合適的基底上用于分析。濾膜具有多種尺寸、過濾材質(zhì)和孔徑尺寸，以便優(yōu)化過濾過程。某些過濾材料在光譜的紅外線區(qū)域內(nèi)具有顯著的吸附作用，并且這些材料將掩蓋因感興趣的顆粒引起的吸附。因此，采用最合適的過濾材料極其重要。一系列不同的濾膜類型和尺寸已得以評(píng)價(jià)，以便為紅外顯微鏡的微塑料分析確定最佳濾膜類型（表2）
表2. 評(píng)估一系列不同的濾膜與顯微紅外測(cè)試的適用性
濾膜直徑將影響樣品容量和過濾能力并且應(yīng)保持具有合理的尺寸，以便減少紅外成像所需的時(shí)間。孔徑將決定待截留的最小粒徑，但該尺寸不能易受某些樣品基質(zhì)堵塞。對(duì)于與紅外分析之間的兼容性，（歸因于紅外分析的近似衍射極限）顆粒需大于1.5微米，并且濾膜的可用光譜范圍極其重要。每個(gè)濾膜的相對(duì)成本可能非常重要，但是對(duì)于樣品凈化可能耗費(fèi)幾小時(shí)或幾天時(shí)間的樣品，濾膜的成本就并非十分重要。對(duì)于樣品處理量較高的實(shí)驗(yàn)室，這應(yīng)該是一個(gè)重要的考慮因素。
下文將對(duì)紅外顯微鏡的采樣模式作更詳細(xì)的討論，但是對(duì)于濾膜上的顆粒分析，其選擇通常受限于透射或反射。在進(jìn)行多種顆粒的自動(dòng)測(cè)量時(shí)可使用ATR，但是樣品容易受到交叉污染。濾膜類型需要在透射或反射模式下對(duì)紅外光不出現(xiàn)任何顯著的吸收。表1所示是記錄了濾膜的紅外透射和反射光譜，并確定每種類型的可用范圍。圖2a所示為透射模式總結(jié)，而圖2b所示為反射模式總結(jié)。
圖2a和2b.不同濾膜類型的透射和反射范圍
鍍金聚碳酸酯濾膜具有較好的反射能量，但無透射能量，而PVDF濾膜在透射和反射模式下均顯示出顯著的吸收帶，因此不合適。
建議使用硅濾膜進(jìn)行透射分析，并使用硅、銀膜或鍍金聚碳酸酯進(jìn)行反射分析。
硅的缺點(diǎn)是相對(duì)成本較高以及不是標(biāo)準(zhǔn)過濾系統(tǒng)所直接兼容的尺寸，屬于“非標(biāo)準(zhǔn)”尺寸（矩形尺寸）。
兩種不同濾膜類型的示例光譜如圖3所示。
圖3. 不同類型濾膜的透射和反射范圍
06
顯微紅外分析
圖4.珀金埃爾默Spotlight 400紅外成像系統(tǒng)
采樣模式
采用紅外測(cè)量常規(guī)樣品的原則，使用顯微紅外對(duì)微塑料樣品進(jìn)行測(cè)量。采樣模式是透射、反射或ATR。相同的優(yōu)勢(shì)和不足之處同樣適用于顯微紅外。
透射
為在透射模式下測(cè)量樣品，樣品應(yīng)置于合適的紅外透射基底上。樣品厚度通常應(yīng)小于50微米，以免達(dá)到吸收飽和。如果分析包含少量顆粒，且可能“挑選”顆粒，則最好的方法是將顆粒定位于顯微鏡樣品載物架的13 mm KBr窗片上。如此可確保分離顆粒，并將采集到顆粒的純光譜。如果顆粒厚度大于50微米，則可將樣品置于微型金剛石壓池中，壓至更薄的尺寸，可以在顯微鏡臺(tái)上進(jìn)行透射測(cè)量。但是，在大多數(shù)情況下，即使使用顯微鏡工具，樣品也顯得太厚或不容易分離。如前所述，可使用合適的紅外透射模式的濾膜，而無需制備樣品或?qū)㈩w粒移除至其他基底上。另外，在大多數(shù)情況下，某些顆粒的尺寸小于50微米，而另一些則更大。去除大量顆粒的過程耗時(shí)長(zhǎng)且困難。
反射
當(dāng)分析目的是定性樣品時(shí)，通常不在本體聚合物上進(jìn)行反射測(cè)量（直接鏡面反射法）。所獲得的光譜將包含混合的光譜成分，即表面反射和透射/反射成分。此類成分會(huì)導(dǎo)致光譜失真，特別是光譜的較強(qiáng)波段，并會(huì)干擾光譜庫(kù)的搜索過程。但是，透射/反射成分通常可能是主要的光譜貢獻(xiàn)，并產(chǎn)生可識(shí)別的光譜。當(dāng)紅外光束照射到樣品時(shí)，一些光束將直接反射離開樣品表面，其余光束將進(jìn)入（透射）或穿過樣品。如果將樣品置于高反射基底上，如金反射鏡或反射濾膜，則光束將反射離開該基底并回穿樣品，從而有效地提供雙重透射。因此，從反射測(cè)量中可獲得優(yōu)質(zhì)的光譜，但是，最強(qiáng)波段可能非常強(qiáng)。對(duì)于有一定厚度的樣品，反射比透射效果好。
ATR
ATR已成為在FT-IR儀器上簡(jiǎn)單測(cè)量和識(shí)別樣品的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。該技術(shù)無需制備樣品，并且可作用于一系列不同的樣品尺寸，包括在透射或反射方面不起作用的厚度過大的樣品。這是一種表面測(cè)試技術(shù)，因此，所獲得的光譜是材料表面的光譜，而非體積光譜。此外，所測(cè)量的有效樣品厚度處于1或2微米的范圍內(nèi)，這導(dǎo)致紅外光譜較弱。但是，所獲得的光譜強(qiáng)度足以識(shí)別材料或材料的主要成分。顯微紅外可配備微型ATR晶體，以對(duì)微粒進(jìn)行自動(dòng)ATR測(cè)量。如果樣品位于堅(jiān)硬的固體基底上，如金反射鏡、窗口材料或顯微鏡載玻片，并且含有非常少量的顆粒，則在每次測(cè)量/顆粒之后，只要清潔ATR晶體，ATR即可成為一種可使用的技術(shù)。ATR的測(cè)試原則是基底與ATR晶體之間的對(duì)樣品的壓縮。在測(cè)量之后即釋放壓力時(shí)，樣品經(jīng)常留在ATR晶體上，而并非回到基底上。因此，如果在不清潔晶體的情況下測(cè)量多個(gè)顆粒，交叉污染將是一個(gè)主要問題。因此，通常不采用顯微ATR采樣模式。
在ATR成像中，表面明顯較大的ATR晶體與樣品接觸，并在整個(gè)晶體表面上進(jìn)行ATR測(cè)量。
07
顯微紅外的測(cè)量模式
紅外顯微鏡能夠測(cè)量單個(gè)微觀粒子，但其還有一個(gè)額外的優(yōu)點(diǎn)，即能夠以全自動(dòng)模式運(yùn)行來測(cè)量樣品中的多個(gè)顆粒，也能夠?qū)φ麄€(gè)樣品（如完整的濾膜）進(jìn)行繪圖（map）或成像（image）。自動(dòng)化應(yīng)用于每種前述的不同的采樣模式。顯微鏡還配有可視攝像機(jī)，以允許操作員查看其正在使用的樣品，并設(shè)置位置進(jìn)行分析。
點(diǎn)模式
在點(diǎn)模式下，軟件允許用戶選擇一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)于顆粒的測(cè)量位置。然后，紅外顯微鏡將驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)至測(cè)量位置，以進(jìn)行掃描，然后移動(dòng)至下一個(gè)樣品位置。如果樣品含有少量顆粒，則上述方法可能是一種非常快的光譜收集方法。對(duì)于每個(gè)位置，軟件控制的光闌大小應(yīng)可視地包圍顆粒，以避免雜散光。與標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜測(cè)量一樣，需采用合適的背景掃描，并且應(yīng)使用與樣品掃描相同的孔徑尺寸在紅外顯微鏡上來執(zhí)行。對(duì)于透射，應(yīng)在無樣品的空白區(qū)中測(cè)量背景。對(duì)于反射，應(yīng)在反射基底的空白區(qū)中記錄背景。對(duì)于ATR，應(yīng)使用干凈的晶體來測(cè)量背景。
軟件內(nèi)的顆粒檢測(cè)算法能夠分析可見圖像來發(fā)現(xiàn)樣品內(nèi)顆粒的存在。然后，軟件將自動(dòng)掃描所有顆粒和適當(dāng)背景的光譜。相對(duì)于手動(dòng)選擇分析位置，該方法具有顯著的速度優(yōu)勢(shì)，或者，如果對(duì)整個(gè)樣品進(jìn)行繪圖或成像，則可節(jié)省大量時(shí)間。圖5所示為顆粒識(shí)別工具。
圖5. 分析圖像發(fā)現(xiàn)存在的顆粒（點(diǎn)擊查看大圖）
繪圖（Mapping）
Mapping實(shí)驗(yàn)涉及定義待測(cè)量的樣品面積（這可能是幾毫米），以及定義整個(gè)樣品上測(cè)量的X、Y間距。例如，如果樣品為0.7 mm×1 mm，并且應(yīng)每100微米進(jìn)行一次測(cè)量，則Mapping實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行70次測(cè)量（7×10）。在每個(gè)點(diǎn)上收集紅外光譜，并在整個(gè)面積上生成樣品的紅外圖。
Mapping實(shí)驗(yàn)利用紅外顯微鏡中存在的單點(diǎn)檢測(cè)器（通常是MCT檢測(cè)器），并將測(cè)量單個(gè)光譜、移動(dòng)載物臺(tái)、測(cè)量光譜，移動(dòng)載物臺(tái)。對(duì)于小樣本區(qū)域或大XY間距，這已足夠。但是，對(duì)于大樣本區(qū)域（如濾膜），或測(cè)量小XY間距的非常小的顆粒，Mapping實(shí)驗(yàn)可能非常慢，并且需要很長(zhǎng)時(shí)間。
成像（Imaging）
成像Imaging實(shí)驗(yàn)類似于繪圖Mapping實(shí)驗(yàn)，不同之處在于成像實(shí)驗(yàn)使用具有元件陣列的檢測(cè)器同時(shí)測(cè)量多個(gè)點(diǎn) , 而非單個(gè)檢測(cè)器元件，導(dǎo)致整體測(cè)量速度顯著加快。陣列檢測(cè)器可能是線性陣列或焦平面陣列。線性陣列具有幾何形狀n×1，其中n通常為16或32，而焦平面陣列具有幾何形狀n×n，其中n通常為16、64 或128。焦平面陣列檢測(cè)器的價(jià)格較高，并且其光譜截止值約為s/b 950 cm -1 ，以致于忽略某些重要的光譜信息，而線性陣列檢測(cè)器具有低至s/b 600 cm -1的完整MCT光譜范圍。
圖6.Mapping實(shí)驗(yàn)收集一行數(shù)據(jù)點(diǎn)，然后移動(dòng)至下一行，直至完成為止
圖7a和7b.（a）線性陣列檢測(cè)器收集一“列”數(shù)據(jù)點(diǎn)，然后移動(dòng)至下一“列”。（b）焦平面陣列檢測(cè)器在一次測(cè)量中收集數(shù)列和數(shù)行數(shù)據(jù)點(diǎn)
紅外成像的一個(gè)示例如圖8所示。
圖8. 從化妝品配方中過濾的微塑料顆粒的總紅外吸光度圖像
在紅外圖像中的每個(gè)像素均有與之相關(guān)的完整的紅外光譜。在點(diǎn)模式下工作時(shí)，系統(tǒng)將每個(gè)顆粒生成一個(gè)光譜。在圖像模式下工作時(shí)，系統(tǒng)將每像素生成1個(gè)光譜，從而導(dǎo)致每次實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)。例如，以6.25 μm像素大小測(cè)量的10 mm × 10 mm圖像將包含超過250萬(wàn)個(gè)光譜。軟件的各種處理工具均考慮到簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)解析步驟，強(qiáng)大的是主成分分析（PCA）。在珀金埃爾默光譜圖像軟件中，該分析法通過選擇Show Structure功能得以引用。該功能將使用PCA在樣品內(nèi)尋找不同的化學(xué)組分。不同的PCA組分將表示存在的不同材料，并針對(duì)不同組分生成圖像，以指示樣品內(nèi)不同材料的分布位置。圖9a-d所示為一個(gè)示例。
圖9a-d.（a）總吸光度紅外圖像。（b）顯示混合組分的PCA分析。不同的組分采用不同的顏色，以區(qū)分不同的化學(xué)成分類型。（c）2組分圖像.（d）4組分圖像（點(diǎn)擊查看大圖）
圖10. 觀察到的顆粒光譜；組分4的圖像即聚乙烯（頂部），以及組分2的圖像即聚丙烯（底部）
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